Отслеживание высвобождения микроРНК во внеклеточные везикулы с помощью проточной цитометрии
Summary
Здесь мы описываем простой протокол, который позволяет in vitro оценить обилие флуоресцентно меченных микроРНК для изучения динамики упаковки микроРНК и экспорта во внеклеточные везикулы (ВВ).
Abstract
Внеклеточные везикулы (ВВ) являются важными медиаторами клеточной коммуникации, которые секретируются различными клетками. Эти ВВ переносят биологически активные молекулы, включая белки, липиды и нуклеиновые кислоты (ДНК, мРНК, микроРНК и другие некодирующие РНК), из одной клетки в другую, что приводит к фенотипическим последствиям в клетках-реципиентах. МикроРНК (микроРНК) привлекли большое внимание из-за их роли в формировании микроокружения и в обучении клеток-реципиентов из-за их явной дисрегуляции и обилия в ВВ. Дополнительные данные указывают на то, что многие микроРНК активно загружаются в электромобили. Несмотря на эти четкие доказательства, исследования динамики экспорта и механизмов сортировки микроРНК ограничены. Здесь мы приводим протокол с использованием анализа EV-микроРНК методом проточной цитометрии, который может быть использован для понимания динамики загрузки EV-микроРНК и выявления механизмов, участвующих в экспорте микроРНК. В этом протоколе микроРНК, предварительно определенные для обогащения в ВВ и обедненные из донорских клеток, конъюгируются с флуорофором и трансфицируются в донорские клетки. Затем флуоресцентно меченные микроРНК проверяются на загрузку в ВВ и истощение клеток с помощью кОТ-ПЦР. В качестве средства контроля трансфекции и инструмента для стробирования трансфицированной популяции клеток используется флуоресцентно меченная клеточная РНК (с сохранением клеток и с истощением EV). Клетки, трансфицированные как EV-микроРНК, так и клеточной миРНК, оцениваются на флуоресцентные сигналы в течение 72 часов. Интенсивность флуоресцентного сигнала, специфичная для EV-микроРНК, быстро уменьшается по сравнению с клеточной микроРНК. Используя этот простой протокол, теперь можно оценить динамику загрузки микроРНК и определить различные факторы, ответственные за загрузку микроРНК в ВВ.
Introduction
МикроРНК (микроРНК) являются одним из наиболее хорошо охарактеризованных подмножеств малых некодирующих РНК, которые известны своей важнейшей ролью в посттранскрипционной регуляции генов. Экспрессия и биогенез большинства микроРНК следуют скоординированной серии событий, которые начинаются с транскрипции первичных микроРНК (при-миРНК) в ядре. После ядерной обработки микропроцессорным комплексом в микроРНК-предшественники (пре-микроРНК) пре-микроРНК экспортируются в цитоплазму, где подвергаются дальнейшей обработке эндонуклеазой РНКазы III, разделенной на 21-23 нуклеотидные зрелые дуплексымикроРНК 1. Одна из цепей обработанной зрелой микроРНК связывается с матричными РНК-мишенями (мРНК), что приводит к деградации или трансляционному подавлению мишеней2. Основываясь на плейотропной роли микроРНК в одновременной регуляции нескольких различных мРНК-мишеней, неудивительно, что экспрессия микроРНКжестко регулируется. Действительно, неправильное выражение способствует возникновению различных болезненных состояний, особенно при раке. Аберрантная экспрессия микроРНК не только представляет собой специфическую для заболевания сигнатуру, но и стала мишенью для прогностического и терапевтического потенциала 4,5,6. В дополнение к своим внутриклеточным ролям, микроРНК также выполняют неавтономные функции. Например, микроРНК могут быть селективно упакованы в ВВ донорскими клетками и экспортированы в реципиенты, где они вызывают различные фенотипические реакции в норме и физиологии заболевания 7,8,9.
Несмотря на четкие доказательства того, что ВВ-ассоциированные микроРНК являются функциональными биомолекулами, до конца не ясно, как определенные подмножества микроРНК нарушают регуляцию при таких болезненных состояниях, как рак, и как клеточные механизмы отбирают и сортируют микроРНК в Evs 10,11. Учитывая потенциальную роль EV-микроРНК в модуляции микроокружения, крайне важно определить механизмы, участвующие в экспорте отдельных микроРНК, чтобы полностью прояснить роль EV в межклеточной коммуникации и патогенезе заболевания. Понимание процесса высвобождения микроРНК в ВВ не только выявит важные медиаторы экспорта микроРНК, но и может дать представление о потенциальных терапевтических средствах. Чтобы достичь такого уровня знаний, необходимо адаптировать инструменты для точного ответа на эти новые экспериментальные вопросы. Действительно, количество исследований, в которых оцениваются электромобили, растет в геометрической прогрессии из-за внедрения новых методов и средств контроля12,13. Что касается оценки обилия экспортируемых микроРНК в ВВ, то в настоящее время стандартными инструментами являются секвенирование нового поколения и количественная полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией (кОТ-ПЦР). Несмотря на то, что эти инструменты полезны для оценки количества микроРНК в ВВ, существуют ограничения на их чувствительность и специфичность, и использование этих статических подходов для оценки динамики недостаточно. Определение динамики экспорта микроРНК в ВВ требует комбинации специализированных инструментов. Здесь мы представляем комплексный протокол с использованием флуоресцентно конъюгированных микроРНК для анализа динамики высвобождения микроРНК из донорских клеток и встраивания в ВВ. Мы также обсудим преимущества и ограничения метода и дадим рекомендации по оптимальному использованию. Универсальный метод, представленный в этой статье, будет полезен исследователям, заинтересованным в изучении высвобождения микроРНК в ВВ и их потенциальной роли в клеточной коммуникации и заболеваниях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Новый протокол позволяет фиксировать кинетику высвобождения микроРНК в ВВ после трансфекции ВВ-микроРНК. Подход позволяет проводить одновременный анализ нескольких EV-микроРНК и клеточных микроРНК при условии использования возможностей цитометра. Более того, несмотря на то, что анал?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы признательны за поддержку и советы д-ру Джилл Хатчкрофт (Jill Hutchcroft), директору центра проточной цитометрии в Университете Пердью. Эта работа была поддержана R01CA226259 и R01CA205420 для A.L.K., премией Американской ассоциации пульмонологов (ANALA2023) IA-1059916 для A.L.K., грантом Purdue Shared resource facility P30CA023168 и флагманской докторской стипендией Фулбрайта, присужденной Государственным департаментом, США Его Святейшеству.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tubes | Fisher | 05-408-129 | |
| 15 mL Falcon tubes | Corning | 352097 | |
| 6-well clear flat bottom surface treated tissue culture plates | Fisher Scientific | FB012927 | |
| ApogeeMix 25 mL, (PS80/110/500 & Si180/240/300/590/880/1300 nm) | Apogee Flow Systems | 1527 | To set up gating and parameters for particle detection |
| Attune Nxt Flow Cytometer | ThermoFisher Scientific | N/A | For fluorescence analysis in EVs |
| BD Fortessa Cell Analyzer | BD Biosciences | N/A | For fluorescence analysis in cells |
| Cell culture incubator | N/A | N/A | Maintaining temperature of 37 °C and 5% CO2 |
| Cell Culture medium | N/A | N/A | specific for the cell-line of interest |
| Cell line of interest | N/A | N/A | Any cell line tested and evaluated for EV and cellular abundance of miRNAs on interest. |
| Cell-miRNA (miRIDIAN microRNA Mimic Red Transfection Control) | Horizon discovery | CP-004500-01-05 | miRNAs predetermined to be retained by the cell-line of interest and not selectively exported out into EVs |
| EV-miRNA (Fluorophore conjugated miRNAs) | Integrated DNA Technologies (IDT) | miRNAs predetermined to be selectively sorted into EVs | |
| Fluorescence microscope | N/A | N/A | |
| Gibco Opti-MEM Reduced Serum Medium | Fisher Scientific | 31-985-070 | |
| Hausser Scientific Hemocytometer | Fisher | 02-671-54 | |
| Hyclone 1x PBS (for cell culture) | Fisher | SH30256FS | |
| Lipofectamine RNAimax | Fisher Scientific | 13-778-150 | |
| miRCURY LNA Reverse Transcriptase | Qiagen | 339340 | |
| miRCURY LNA SYBR Green PCR | Qiagen | 339347 | |
| mirVana RNA Isolation | Qiagen | AM1561 | |
| Nuclease free water | Fisher Scientific | 4387936 | |
| Paraformaldehyde, 4% in PBS | Fisher | AAJ61899AK | |
| Reagent reservoir nonsterile | VWR | 89094-684 | |
| Thermo ABI QuantiStudio DX Real-Time PCR | ThermoFisher Scientific | N/A | |
| Trypsin 0.25% | Fisher | SH3004201 | |
| Ultracentrifuge | N/A | N/A |
References
- Kasinski, A. L., Slack, F. J. MicroRNAs en route to the clinic: Progress in validating and targeting microRNAs for cancer therapy. Nature Reviews Cancer. 11 (12), 849-864 (2011).
- Treiber, T., Treiber, N., Meister, G. Regulation of microRNA biogenesis and its crosstalk with other cellular pathways. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 20 (1), 5-20 (2019).
- Lu, J., et al. MicroRNA expression profiles classify human cancers. Nature. 435 (7043), 834-838 (2005).
- Orellana, E., Tenneti, S., Rangasamy, L., Lyle, L., Low, P., Kasinski, A. FolamiRs: Ligand-targeted, vehicle-free delivery of microRNAs for the treatment of cancer. Science Translational Medicine. 9 (401), eaam9327 (2017).
- Orellana, E., et al. Enhancing microRNA activity through increased endosomal release mediated by nigericin. Molecular Therapy- Nucleic Acids. 16, 505-518 (2019).
- Abdelaal, A. M., et al. A first-in-class fully modified version of miR-34a with outstanding stability, activity, and anti-tumor efficacy. Oncogene. , (2023).
- Crescitelli, R., et al. Distinct RNA profiles in subpopulations of extracellular vesicles: Apoptotic bodies, microvesicles and exosomes. Journal of Extracellular Vesicles. 2, (2013).
- Hasan, H., et al. Extracellular vesicles released by non-small cell lung cancer cells drive invasion and permeability in non-tumorigenic lung epithelial cells. Scientific Reports. 12 (1), 972 (2022).
- Costa-Silva, B., et al. Pancreatic cancer exosomes initiate pre-metastatic niche formation in the liver. Nature Cell Biology. 17 (6), 816-826 (2015).
- Villarroya-Beltri, C., et al. Sumoylated hnRNPA2B1 controls the sorting of miRNAs into exosomes through binding to specific motifs. Nature Communications. 4, 2980 (2013).
- Cha, D., et al. KRAS-dependent sorting of miRNA to exosomes. elife. 4, e07197 (2015).
- Gandham, S., et al. Technologies and standardization in research on extracellular vesicles. Trends in Biotechnology. 38 (10), 1066-1098 (2020).
- Théry, C., et al. Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018): a position statement of the International Society for Extracellular Vesicles and update of the MISEV2014 guidelines. Journal of Extracellular Vesicles. 7 (1), 1535750 (2018).
- Kowal, J., et al. Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (8), E968-E977 (2016).
- Sork, H., et al. Heterogeneity and interplay of the extracellular vesicle small RNA transcriptome and proteome. Scientific Reports. 8 (1), 10813 (2018).
- Mittelbrunn, M., et al. Unidirectional transfer of microRNA-loaded exosomes from T cells to antigen-presenting cells. Nature Communications. 2, 282 (2011).
- Chiou, N. T., Kageyama, R., Ansel, K. M. Selective export into extracellular vesicles and function of tRNA fragments during T cell activation. Cell Reports. 25 (12), 3356-3370 (2018).
- Guzewska, M. M., Witek, K. J., Karnas, E., Rawski, M., Zuba-Surma, E., Kaczmarek, M. M. miR-125b-5p impacts extracellular vesicle biogenesis, trafficking, and EV subpopulation release in the porcine trophoblast by regulating ESCRT-dependent pathway. The FASEB Journal. 37 (8), e23054 (2023).
