Desarrollo y caracterización de hidrogeles de matriz extracelular pulmonar descelularizada
Summary
El protocolo dilucida dos metodologías de descelularización distintas aplicadas a los tejidos pulmonares bovinos nativos, proporcionando una descripción completa de sus respectivas caracterizaciones.
Abstract
El uso de hidrogeles derivados de la matriz extracelular (MEC) en la ingeniería de tejidos se ha vuelto cada vez más popular, ya que pueden imitar el entorno natural de las células in vitro. Sin embargo, mantener el contenido bioquímico nativo de la MEC, lograr la estabilidad mecánica y comprender el impacto del proceso de descelularización en las propiedades mecánicas de los hidrogeles de la MEC es un desafío. Aquí, se describió una línea para la descelularización del tejido pulmonar bovino utilizando dos protocolos diferentes, la caracterización posterior de la efectividad de la descelularización, la fabricación de hidrogeles de MEC pulmonar descelularizada reconstituida y la evaluación de sus propiedades mecánicas y de citocompatibilidad. La descelularización del pulmón bovino se llevó a cabo mediante un método físico (ciclos de congelación-descongelación) o químico (a base de detergente). Se realizó tinción con hematoxilina y eosina para validar la descelularización y retención de los principales componentes de la MEC. Para la evaluación del contenido residual de colágeno y glicosaminoglicanos sulfatados (sGAG) dentro de las muestras descelularizadas, se emplearon técnicas de tinción con rojo de Sirio y azul alcián, respectivamente. Las propiedades mecánicas de los hidrogeles de MEC pulmonar descelularizados se caracterizaron mediante reología oscilatoria. Los resultados sugieren que los hidrogeles pulmonares bovinos descelularizados pueden proporcionar una alternativa organotípica fiable a los productos comerciales de MEC al conservar la mayoría de los componentes nativos de la MEC. Además, estos hallazgos revelan que el método de descelularización elegido afecta significativamente a la cinética de gelificación, así como a la rigidez y las propiedades viscoelásticas de los hidrogeles resultantes.
Introduction
Las condiciones convencionales de cultivo de monocapa no ofrecen una representación fiel de los microambientes de los tejidos nativos y carecen de la capacidad de proporcionar un andamio tridimensional (3D) con ligandos instructivos que permitan las interacciones célula-matriz y célula-célula1. La composición de la matriz extracelular (MEC) y las propiedades mecánicas son altamente específicas de los tejidos, dependientes del tiempo y sufren alteraciones en condiciones patológicas. Por lo tanto, existe la necesidad de modelos tisulares biomiméticos en 3D que permitan la sintonización de dichas características, la modulación del comportamiento celular y el logro de la funcionalidad tisular deseada. Los biomateriales nativos derivados de la MEC atraen mucha atención en la ingeniería de tejidos con la capacidad de utilizar directamente la MEC 1,2,3,4,5 específica del tejido. Los portadores basados en ECM se han utilizado en muchas aplicaciones, desde la regeneración de tejidos hasta el desarrollo de modelos de enfermedades. Se utilizan como andamios de biomateriales inyectables o implantables 4,5, en aplicaciones de cribado de fármacos 6,7, en el desarrollo de materiales que inducen el crecimiento celular 8,9,10, como biotintas 11,12,13, en microfluídica14 y en modelos de tejido canceroso 15,16,17,18,19.
La descelularización de tejidos y órganos es un enfoque popular para generar andamios que imitan la MEC específica del tejido. La reconstitución de tejidos y órganos descelularizados en hidrogeles permite la inclusión de células en modelos biomiméticos de tejidos 3D20. Las técnicas de descelularización se centran principalmente en eliminar los componentes celulares conservando la composición de la MEC. Los métodos físicos, como los ciclos de congelación y descongelación o los procesos químicos, como el tratamiento con Triton-X-100, se aplican comúnmente para descelularizar los tejidos. Además, se prefiere el tratamiento con DNasa para eliminar el ADN residual con el fin de minimizar las respuestas inmunológicas tras la inclusión celular. Es fundamental lograr la máxima eliminación celular y el mínimo deterioro de la MEC para optimizar los procedimientos de descelularización21. Además de estos aspectos, la caracterización de las propiedades bioquímicas y mecánicas de los andamios reconstituidos, incluyendo la viscoelasticidad y la rigidez, es crucial para mejorar los modelos de tejidos 3D de ingeniería derivados de matrices nativas20.
La MEC específica de órganos en la ingeniería de tejidos pulmonares permite imitar el microambiente pulmonar para modelar procesos de desarrollo, homeostáticos o patológicos in vitro y probar terapias en un entorno fisiomimético 20,22,23. Estudios anteriores han demostrado la descelularización del tejido pulmonar de varias especies, como ratas, porcinos y humanos, pero estos métodos aún no se han adaptado a especies de uso menos frecuente, como los bovinos. Una mejor comprensión de los parámetros del proceso de descelularización y cómo afectan a los andamios de MEC reconstituidos resultantes en cuanto a composición bioquímica y propiedades mecánicas permitirá un mejor ajuste de estos aspectos y allanará el camino para modelos de tejidos más fiables en salud y enfermedad. En este estudio, se describe explícitamente la descelularización pulmonar bovina con dos métodos distintos, ciclos de congelación-descongelación y tratamiento con Triton-X-100, seguida de análisis bioquímicos y mecánicos de hidrogeles de MEC pulmonar descelularizada (dECM). Los resultados revelan que ambos métodos producen una descelularización y retención efectivas de los ligandos de la MEC. En particular, la elección del método altera significativamente la rigidez y la viscoelasticidad resultantes de los hidrogeles reconstituidos. Los hidrogeles derivados de la dECM bovina demuestran notables analogías bioquímicas con la matriz extracelular del pulmón humano, y exhiben características confiables de gelificación térmica20. Como se describió anteriormente, ambos métodos son adecuados para el cultivo 3D de células de cáncer de pulmón, células epiteliales bronquiales sanas y organoides pulmonares derivados del paciente20.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los hidrogeles derivados de órganos se han convertido en modelos prometedores que recapitulan la MEC del tejido nativo e imitan la función celular organotípica. Aunque la MEC pulmonar descelularizada se ha utilizado a menudo en la ingeniería de tejidos, una caracterización exhaustiva de la composición del biomaterial y las propiedades mecánicas beneficiará una mejor comprensión de cómo se pueden modular las interacciones célula-MEC para modelar los procesos biológicos durante la homeostasis o la enfermedad. E…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por el Consejo de Investigación Científica y Tecnológica de Turquía (TÜBİTAK) (Subvención No. 118C238). Toda la responsabilidad de la publicación/artículo pertenece al propietario de la publicación. El apoyo financiero recibido de TÜBİTAK no significa que el contenido de la publicación esté aprobado en un sentido científico por TÜBİTAK. Los autores agradecen el uso de los servicios e instalaciones del Centro de Investigación de Medicina Traslacional de la Universidad de Koç (KUTTAM). La Figura 1 y la Figura 2a se crearon utilizando Biorender.com.
Materials
| Absolute ethanol | ISOLAB | 64-17-5 | |
| Acetic acid | ISOLAB | 64-19-7 | |
| Alcian blue solution | Sigma-Aldrich | B8438 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | DN25 | |
| Discovery HR-2 rheometer | TA Instruments | ||
| Entellan mounting medium | Merck | 107960 | |
| Eosin solution | Bright-slide | 2.BS01-105-1000 | |
| Formaldehyde | Electron Microscopy Sciences | 50-980-485 | |
| Hydrochloric acid | Merck | 100317 | |
| Iodine | Sigma-Aldrich | 3002 | |
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | |
| Mayer's haematoxylin staining solution | Merck | 2.BS01-103-1000 | |
| O.C.T compound | Tissue-Tek | 4583 | |
| Penicillin/Streptomycin | Biowest | L0018-100 | |
| Pepsin from porcine gastric mucosa | Sigma-Aldrich | P6887 | |
| Picric acid | Polysciences | 88-89-1 | |
| Sirius Red | Polysciences | 09400-25 | |
| Sodium hydroxide | Sigma-Aldrich | S5881 | |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | S0389 | |
| Triton-X-100 | Merck | 112298 |
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