Hepatocytter afledt af pluripotente stamceller kan oprenses gennem cellesortering ved hjælp af en kombination af mitokondrielt og aktiveret leukocytcelleadhæsionsmolekyle (ALCAM, også kendt som CD166) farvning.
Humane embryonale stamceller (ES) og inducerede pluripotente stamceller (iPS) har potentielle anvendelser inden for cellebaseret regenerativ medicin til behandling af alvorligt syge organer på grund af deres ubegrænsede spredning og pluripotente egenskaber. Det er dog en udfordring at differentiere humane ES/iPS-celler i 100 % rene målcelletyper på grund af deres høje følsomhed over for miljøet. Tumorgenese efter transplantation er forårsaget af forurenede, prolifererende og udifferentierede celler, hvilket gør højrensningsteknologi afgørende for sikker realisering af regenerativ medicin. For at mindske risikoen for tumorgenese er der udviklet en højoprensningsteknologi til humane iPS-celleafledte hepatocytter. Metoden anvender FACS (fluorescensaktiveret cellesortering) ved hjælp af en kombination af højt mitokondrieindhold og celleoverflademarkøren ALCAM (aktiveret leukocytcelleadhæsionsmolekyle) uden genetisk modifikation. 97 % ± 0,38 % (n = 5) af de oprensede hepatocytter ved hjælp af denne metode udviste albuminproteinekspression. Denne artikel har til formål at give detaljerede procedurer for denne metode, som anvendes på den nyeste todimensionelle differentieringsmetode for humane iPS-celler til hepatocytter.
Embryonale og inducerede pluripotente stamceller (henholdsvis ES og iPS) betragtes som lovende cellekilder til regenerative terapier. Effektiviteten af at differentiere disse celler til specifikke målcelletyper kan dog variere, selv når du bruger den samme cellelinje, protokol og eksperimentator 1,2,3,4. Denne variation kan tilskrives den høje følsomhed af humane ES/iPS-celler over for deres miljø. Derfor er det i øjeblikket vanskeligt konsekvent at opnå rene målceller. For at opnå meget sikker regenerativ medicin er det afgørende at eliminere proliferative celler og udifferentierede stamceller i terapeutiske celler, og avanceret oprensningsteknologi til målceller er afgørende 5,6,7.
En cellesorterer er en enhed, der øjeblikkeligt analyserer individuelle celler og sorterer levende celler af interesse baseret på de fluorescerende signalstyrker, hvilket giver en lovende løsning. Dette kan opnås gennem antistoffarvning af celletypespecifikke overflademarkører eller ved at bruge celletypespecifikke reportergenekspressioner. Ved hjælp af denne teknik er der flere rapporter om metoder til oprensning af pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter 8,9,10 og hepatocytter11,12. Hattori et al. udviklede en innovativ mitokondriel oprensningsmetode ved hjælp af en cellesorterer13. Ved at drage fordel af det faktum, at kardiomyoocytter har høje energibehov gennem mitokondrieaktivitet, kan farvning af cellerne med det levende mitokondrie-indikative farvestof TMRM (tetramethylrhodaminmethylester) bruges til at mærke og stærkt oprense kardiomyoocytter ved FACS fra humane ES-celleafledte embryoide kroppe, der indeholder forskellige celletyper. Fraværet af tumorigenicitet blev bekræftet ved teratomdannelsesanalyser med de oprensede kardiomyocytter. Desuden opdagede Yamashita et al. uventet en metode til at rense hepatocytter fra humane ES-celleafledte embryoidlegemer ved at isolere fraktioner med høj mitokondrieaktivitet og ALCAM-positiv ekspression14. Rationalet for denne metode er, at hepatocytter også har et relativt højt antal mitokondrier på grund af deres høje forbrug af ATP til næringsstofmetabolisme og afgiftning15, og hepatocytter udtrykker ALCAM, et medlem af immunglobulin-superfamilien, som spiller en rolle i celleadhæsion og migration16.
Tidligere højrensende metoder til pluripotente stamcelleafledte hepatocytter krævede genetiske modifikationer, og ikke-genetiske oprensningsmetoder havde lav effektivitet17. Den mitokondrielle ikke-genetiske metode har fortjeneste for at opnå høj renhed. Når der er behov for leverstamceller, kan CD133- og CD13- eller Dlk1-baserede metoder18,19 vælges. Selvom nøjagtigheden af genomredigeringsteknologien er avanceret, kan den potentielle risiko for uforudsete genomiske ændringer (f.eks. karcinogenese) ikke helt elimineres. Metoder baseret på mitokondriel aktivitet, uden at involvere genetisk modifikation, kan være fri for sådanne risici.
Som et resultat af undersøgelse af forskellige mitokondrielle indikatorer i neonatale rottekardiomyocytter blev TMRM observeret at forsvinde helt inden for 24 timer, mens andre farvestoffer forblev i mindst 5 dage13. Desuden er det vigtigt at bemærke, at TMRM og JC-1 ikke påvirkede cellernes levedygtighed, når de blev vurderet med 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-assayet, mens andre farvestoffer viste varierende virkninger på cellelevedygtighed13. TMRM demonstrerer højere sikkerhed.
Til dato er flere todimensionelle (2D) differentieringsmetoder blevet udviklet som mere effektive tilgange til at inducere differentiering sammenlignet med tredimensionel (3D) embryoid kropsdannelse. Dette skyldes, at trinvise differentieringsinducerende forbindelser eller cytokiner kan administreres ensartet til celler på et 2D-plan snarere end i et 3D-rum. I denne undersøgelse blev den tidligere rapporterede metode20 modificeret til at inducere differentiering til humane iPS-celleafledte hepatocytter. Her beskrives detaljerne i procedurerne for den opdaterede 2D-differentiering og oprensning af hepatocytter afledt af humane iPS-celler.
På grund af deres funktioner i næringsstofmetabolisme og afgiftning har hepatocytter et relativt stort antal mitokondrier sammenlignet med andre celletyper15. ALCAM er medlem af immunglobulin-superfamilien og spiller en rolle i celleadhæsion og migration. Det udtrykkes i forskellige celletyper, herunder lever-, epitel-, lymfocytiske, myeloid-, fibroblast- og neuronale celler16. Ved at anvende en kombination af den mitokondriebaserede metode og ALCAM-antistoffet blev huma…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi bevillingsnummer [23390072].
253G1 human iPS cell line | RIKEN BioResource Research Center | HPS0002 | |
4% paraformaldehyde | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 163-20145 | |
Activin A Solution, Human, Recombinant | NACALAI TESQUE, INC. | 18585 | |
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 | Chemicon | MAB1281 | Antibody against human nuclear antigen |
B-27 Supplement (50x), serum free | Thermo Fisher Scientific | 17504044 | |
BD FACSAria III | BD Biosciences | Cell sorter | |
CHIR-99021 | MedChemExpress | HY-10182 | |
Ciclosporin A | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 035-18961 | |
Collagenase | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 034-22363 | |
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix | Corning | 354230 | Gel-like basement membrane matrix |
CultureSure Y-27632 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 036-24023 | ROCK inhibitor |
Dexamethasone | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-18863 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 047-29353 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-11055 | |
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 | Thermo Fisher Scientific | A10036 | |
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Thermo Fisher Scientific | A-21206 | |
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap | Corning | 352235 | |
Fetal Bovine Serum | Biowest | 51820-500 | |
GlutaMAX Supplement | Thermo Fisher Scientific | 35050061 | Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine |
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody | R&D Systems | AF1172 | |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H2270 | |
iMatrix-511 silk | Nippi | 892021 | |
ImmunoBlock | KAC | CTKN001 | Blocking solution |
ITS-G Supplement(×100) | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 090-06741 | |
Leibovitz's L-15 Medium | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 128-06075 | |
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) | Toronto Research Chemicals | H293745 | |
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin | Dako | A0001 | |
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20) | NACALAI TESQUE, INC. | 28353-85 | |
RPMI-1640 | FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation | 189-02025 | |
Sodium L-Ascorbate | NACALAI TESQUE, INC. | 03422-32 | |
StemFit AK02N | REPROCELL | RCAK02N | |
TBS (10x) | NACALAI TESQUE, INC. | 12748-31 | |
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) | Thermo Fisher Scientific | T668 | |
Triton X-100 | NACALAI TESQUE, INC. | 28229-25 | |
Trypan Blue Solution | NACALAI TESQUE, INC. | 20577-34 | |
TRYPSIN 250 | Difco | 215240 | |
Tryptose phosphate broth solution | Sigma-Aldrich | T8159 |