Summary

Anvendelse af levende mitokondrierfarvning i cellesortering til oprensning af hepatocytter afledt af humant inducerede pluripotente stamceller

Published: December 01, 2023
doi:

Summary

Hepatocytter afledt af pluripotente stamceller kan oprenses gennem cellesortering ved hjælp af en kombination af mitokondrielt og aktiveret leukocytcelleadhæsionsmolekyle (ALCAM, også kendt som CD166) farvning.

Abstract

Humane embryonale stamceller (ES) og inducerede pluripotente stamceller (iPS) har potentielle anvendelser inden for cellebaseret regenerativ medicin til behandling af alvorligt syge organer på grund af deres ubegrænsede spredning og pluripotente egenskaber. Det er dog en udfordring at differentiere humane ES/iPS-celler i 100 % rene målcelletyper på grund af deres høje følsomhed over for miljøet. Tumorgenese efter transplantation er forårsaget af forurenede, prolifererende og udifferentierede celler, hvilket gør højrensningsteknologi afgørende for sikker realisering af regenerativ medicin. For at mindske risikoen for tumorgenese er der udviklet en højoprensningsteknologi til humane iPS-celleafledte hepatocytter. Metoden anvender FACS (fluorescensaktiveret cellesortering) ved hjælp af en kombination af højt mitokondrieindhold og celleoverflademarkøren ALCAM (aktiveret leukocytcelleadhæsionsmolekyle) uden genetisk modifikation. 97 % ± 0,38 % (n = 5) af de oprensede hepatocytter ved hjælp af denne metode udviste albuminproteinekspression. Denne artikel har til formål at give detaljerede procedurer for denne metode, som anvendes på den nyeste todimensionelle differentieringsmetode for humane iPS-celler til hepatocytter.

Introduction

Embryonale og inducerede pluripotente stamceller (henholdsvis ES og iPS) betragtes som lovende cellekilder til regenerative terapier. Effektiviteten af at differentiere disse celler til specifikke målcelletyper kan dog variere, selv når du bruger den samme cellelinje, protokol og eksperimentator 1,2,3,4. Denne variation kan tilskrives den høje følsomhed af humane ES/iPS-celler over for deres miljø. Derfor er det i øjeblikket vanskeligt konsekvent at opnå rene målceller. For at opnå meget sikker regenerativ medicin er det afgørende at eliminere proliferative celler og udifferentierede stamceller i terapeutiske celler, og avanceret oprensningsteknologi til målceller er afgørende 5,6,7.

En cellesorterer er en enhed, der øjeblikkeligt analyserer individuelle celler og sorterer levende celler af interesse baseret på de fluorescerende signalstyrker, hvilket giver en lovende løsning. Dette kan opnås gennem antistoffarvning af celletypespecifikke overflademarkører eller ved at bruge celletypespecifikke reportergenekspressioner. Ved hjælp af denne teknik er der flere rapporter om metoder til oprensning af pluripotente stamcelleafledte kardiomyocytter 8,9,10 og hepatocytter11,12. Hattori et al. udviklede en innovativ mitokondriel oprensningsmetode ved hjælp af en cellesorterer13. Ved at drage fordel af det faktum, at kardiomyoocytter har høje energibehov gennem mitokondrieaktivitet, kan farvning af cellerne med det levende mitokondrie-indikative farvestof TMRM (tetramethylrhodaminmethylester) bruges til at mærke og stærkt oprense kardiomyoocytter ved FACS fra humane ES-celleafledte embryoide kroppe, der indeholder forskellige celletyper. Fraværet af tumorigenicitet blev bekræftet ved teratomdannelsesanalyser med de oprensede kardiomyocytter. Desuden opdagede Yamashita et al. uventet en metode til at rense hepatocytter fra humane ES-celleafledte embryoidlegemer ved at isolere fraktioner med høj mitokondrieaktivitet og ALCAM-positiv ekspression14. Rationalet for denne metode er, at hepatocytter også har et relativt højt antal mitokondrier på grund af deres høje forbrug af ATP til næringsstofmetabolisme og afgiftning15, og hepatocytter udtrykker ALCAM, et medlem af immunglobulin-superfamilien, som spiller en rolle i celleadhæsion og migration16.

Tidligere højrensende metoder til pluripotente stamcelleafledte hepatocytter krævede genetiske modifikationer, og ikke-genetiske oprensningsmetoder havde lav effektivitet17. Den mitokondrielle ikke-genetiske metode har fortjeneste for at opnå høj renhed. Når der er behov for leverstamceller, kan CD133- og CD13- eller Dlk1-baserede metoder18,19 vælges. Selvom nøjagtigheden af genomredigeringsteknologien er avanceret, kan den potentielle risiko for uforudsete genomiske ændringer (f.eks. karcinogenese) ikke helt elimineres. Metoder baseret på mitokondriel aktivitet, uden at involvere genetisk modifikation, kan være fri for sådanne risici.

Som et resultat af undersøgelse af forskellige mitokondrielle indikatorer i neonatale rottekardiomyocytter blev TMRM observeret at forsvinde helt inden for 24 timer, mens andre farvestoffer forblev i mindst 5 dage13. Desuden er det vigtigt at bemærke, at TMRM og JC-1 ikke påvirkede cellernes levedygtighed, når de blev vurderet med 3-(4,5-dimethyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromid (MTT)-assayet, mens andre farvestoffer viste varierende virkninger på cellelevedygtighed13. TMRM demonstrerer højere sikkerhed.

Til dato er flere todimensionelle (2D) differentieringsmetoder blevet udviklet som mere effektive tilgange til at inducere differentiering sammenlignet med tredimensionel (3D) embryoid kropsdannelse. Dette skyldes, at trinvise differentieringsinducerende forbindelser eller cytokiner kan administreres ensartet til celler på et 2D-plan snarere end i et 3D-rum. I denne undersøgelse blev den tidligere rapporterede metode20 modificeret til at inducere differentiering til humane iPS-celleafledte hepatocytter. Her beskrives detaljerne i procedurerne for den opdaterede 2D-differentiering og oprensning af hepatocytter afledt af humane iPS-celler.

Protocol

Denne undersøgelse anvendte kommercielt opnåede humane iPS-celler (253G1-stamme) (se materialetabel). 1. Vedligeholdelse af humane iPS-celler Humane iPS-celler opbevares under fødefri forhold i AK02-medium på dyrkningsskåle belagt med 0,25 μg/cm2 iMatrix-511 (se materialetabel). 2. Hepatisk differentiering af humane iPS-celler i 2D-kulturer …

Representative Results

Tidslinjen for de processer, der inducerer humane iPS-celler til at differentiere sig til hepatocytter gennem 2D-kultur (figur 1A) og repræsentative celletræk (figur 1B) er vist. Cirka på differentieringsdag 12 begyndte celler at udvise polygonale celleformer og runde kerner, der er karakteristiske for hepatocytter. Nogle hepatocytter viste også multinukleation. FACS-analyse blev udført ved hjælp af cellerne på differentierings…

Discussion

På grund af deres funktioner i næringsstofmetabolisme og afgiftning har hepatocytter et relativt stort antal mitokondrier sammenlignet med andre celletyper15. ALCAM er medlem af immunglobulin-superfamilien og spiller en rolle i celleadhæsion og migration. Det udtrykkes i forskellige celletyper, herunder lever-, epitel-, lymfocytiske, myeloid-, fibroblast- og neuronale celler16. Ved at anvende en kombination af den mitokondriebaserede metode og ALCAM-antistoffet blev huma…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Ministeriet for Uddannelse, Kultur, Sport, Videnskab og Teknologi bevillingsnummer [23390072].

Materials

253G1 human iPS cell line RIKEN BioResource Research Center HPS0002
4% paraformaldehyde FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 163-20145
Activin A Solution, Human, Recombinant NACALAI TESQUE, INC. 18585
Anti-Nuclei Antibody, clone 235-1 Chemicon MAB1281 Antibody against human nuclear antigen
B-27 Supplement (50x), serum free Thermo Fisher Scientific 17504044
BD FACSAria III BD Biosciences Cell sorter
CHIR-99021 MedChemExpress HY-10182 
Ciclosporin A FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 035-18961
Collagenase FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 034-22363
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix Corning 354230 Gel-like basement membrane matrix
CultureSure Y-27632 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 036-24023 ROCK inhibitor
Dexamethasone FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 047-18863
Dimethyl sulfoxide (DMSO) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 047-29353
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-11055
Donkey anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 546 Thermo Fisher Scientific A10036
Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 Thermo Fisher Scientific A-21206
Falcon 5 mL Round Bottom Polystyrene Test Tube, with Cell Strainer Snap Cap Corning 352235
Fetal Bovine Serum Biowest 51820-500
GlutaMAX Supplement Thermo Fisher Scientific 35050061 Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Human/Mouse/Rat/Canine ALCAM/CD166 Antibody R&D Systems AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt Sigma-Aldrich H2270
iMatrix-511 silk Nippi 892021
ImmunoBlock KAC CTKN001 Blocking solution
ITS-G Supplement(×100) FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 090-06741
Leibovitz's L-15 Medium FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa) Toronto Research Chemicals H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin Dako A0001
Polyoxyethylene Sorbitan Monolaurate (Tween 20) NACALAI TESQUE, INC. 28353-85
RPMI-1640 FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation 189-02025
Sodium L-Ascorbate NACALAI TESQUE, INC. 03422-32
StemFit AK02N REPROCELL RCAK02N
TBS (10x) NACALAI TESQUE, INC. 12748-31
Tetramethylrhodamine, methyl ester (TMRM) Thermo Fisher Scientific T668
Triton X-100 NACALAI TESQUE, INC. 28229-25
Trypan Blue Solution NACALAI TESQUE, INC. 20577-34
TRYPSIN 250 Difco 215240
Tryptose phosphate broth solution Sigma-Aldrich T8159

References

  1. Yamamoto, T., et al. Differentiation potential of pluripotent stem cells correlates to the level of CHD7. Scientific Reports. 8 (1), 241 (2018).
  2. Laco, F., et al. Unraveling the inconsistencies of cardiac differentiation efficiency induced by the GSK3β inhibitor CHIR99021 in human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 10 (6), 1851-1866 (2018).
  3. Anderson, N. C., et al. Balancing serendipity and reproducibility: Pluripotent stem cells as experimental systems for intellectual and developmental disorders. Stem Cell Reports. 16 (6), 1446-1457 (2021).
  4. Chen, C. X. -. Q., et al. Standardized quality control workflow to evaluate the reproducibility and differentiation potential of human iPSCs into neurons. bioRxiv. , (2021).
  5. Duinsbergen, D., Salvatori, D., Eriksson, M., Mikkers, H. Tumors originating from induced pluripotent stem cells and methods for their prevention. Annals of the New York Academy of Sciences. 1176, 197-204 (2009).
  6. Nori, S., et al. Long-term safety issues of iPSC-based cell therapy in a spinal cord injury model: oncogenic transformation with epithelial-mesenchymal transition. Stem Cell Reports. 4 (3), 360-373 (2015).
  7. Hentze, H., et al. Teratoma formation by human embryonic stem cells: evaluation of essential parameters for future safety studies. Stem Cell Research. 2 (3), 198-210 (2009).
  8. Anderson, D., et al. Transgenic enrichment of cardiomyocytes from human embryonic stem cells. Molecular Therapy. 15 (11), 2027-2036 (2007).
  9. Hidaka, K., et al. Chamber-specific differentiation of Nkx2.5-positive cardiac precursor cells from murine embryonic stem cells. The FASEB Journal. 17 (6), 740-742 (2003).
  10. Gassanov, N., Er, F., Zagidullin, N., Hoppe, U. C. Endothelin induces differentiation of ANP-EGFP expressing embryonic stem cells towards a pacemaker phenotype. The FASEB Journal. 18 (14), 1710-1712 (2004).
  11. Duan, Y., et al. Differentiation and enrichment of hepatocyte-like cells from human embryonic stem cells in vitro and in vivo. Stem Cells. 25 (12), 3058-3068 (2007).
  12. Takayama, K., et al. Enrichment of high-functioning human iPS cell-derived hepatocyte-like cells for pharmaceutical research. Biomaterials. 161, 24-32 (2018).
  13. Hattori, F., et al. Nongenetic method for purifying stem cell-derived cardiomyocytes. Nature methods. 7, 61-66 (2009).
  14. Yamashita, H., Fukuda, K., Hattori, F. Hepatocyte-like cells derived from human pluripotent stem cells can be enriched by a combination of mitochondrial content and activated leukocyte cell adhesion molecule. JMA Journal. 2 (2), 174-183 (2019).
  15. Fernandez-Vizarra, E., Enríquez, J., Pérez-Martos, A., Montoya, J., Fernández-Silva, P. Tissue-specific differences in mitochondrial activity and biogenesis. Mitochondrion. 11, 207-213 (2010).
  16. Swart, G. W. M. Activated leukocyte cell adhesion molecule (CD166/ALCAM): Developmental and mechanistic aspects of cell clustering and cell migration. European Journal of Cell Biology. 81 (6), 313-321 (2002).
  17. Peters, D. T., et al. Asialoglycoprotein receptor 1 is a specific cell-surface marker for isolating hepatocytes derived from human pluripotent stem cells. Development. 143 (9), 1475-1481 (2016).
  18. Kamiya, A., Inagaki, Y. Stem and progenitor cell systems in liver development and regeneration. Hepatology Research. 45 (1), 29-37 (2015).
  19. Yanagida, A., Ito, K., Chikada, H., Nakauchi, H., Kamiya, A. An In vitro expansion system for generation of human ips cell-derived hepatic progenitor-like cells exhibiting a bipotent differentiation potential. PLOS One. 8 (7), e67541 (2013).
  20. Siller, R., Greenhough, S., Naumovska, E., Sullivan, G. J. Small-molecule-driven hepatocyte differentiation of human pluripotent stem cells. Stem Cell Reports. 4 (5), 939-952 (2015).
  21. Hirata, H., et al. ALCAM (CD166) is a surface marker for early murine cardiomyocytes. Cells, Tissues, Organs. 184 (3-4), 172-180 (2006).
  22. Tohyama, S., et al. Distinct metabolic flow enables large-scale purification of mouse and human pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes. Cell Stem Cell. 12 (1), 127-137 (2013).

Play Video

Cite This Article
Yamashita, H., Hattori, F. Application of Live Mitochondria Staining in Cell-Sorting to Purify Hepatocytes Derived from Human Induced Pluripotent Stem Cells. J. Vis. Exp. (202), e65777, doi:10.3791/65777 (2023).

View Video