研究胰腺β细胞线粒体自噬通量的互补方法
Summary
该协议概述了对胰腺β细胞中线粒体自噬进行定量分析的两种方法：第一种是细胞渗透性线粒体特异性染料的组合，第二种是遗传编码的线粒体自噬报告基因。这两种技术是互补的，可以根据特定需求进行部署，从而在定量解决线粒体质量控制问题时具有灵活性和精确性。
Abstract
线粒体自噬是维持最佳线粒体功能所必需的质量控制机制。功能失调的β细胞线粒体自噬导致胰岛素释放不足。线粒体自噬的高级定量评估通常需要使用遗传报告基因。mt-Keima 小鼠模型表达了一种线粒体靶向 pH 敏感的双激发比率探针，用于通过流式细胞术定量线粒体自噬，已在β细胞中进行了优化。酸性与中性 mt-Keima 波长发射的比率可用于稳健地量化线粒体自噬。然而，在处理复杂的遗传小鼠模型或难以转染的细胞（如原代人类胰岛）时，使用遗传线粒体自噬报告基因可能具有挑战性。该协议描述了一种基于互补染料的新型方法，用于使用MtPhagy量化原代胰岛中的β细胞线粒体自噬。MtPhagy 是一种对 pH 敏感的细胞渗透性染料，当线粒体处于低 pH 值环境中时，例如线粒体自噬期间的溶酶体，它会积聚在线粒体中并增加其荧光强度。通过将 MtPhagy 染料与 Fluozin-3-AM（一种选择β细胞的 Zn2+ 指示剂）和四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 相结合来评估线粒体膜电位，可以通过流式细胞术特异性定量β细胞中的线粒体自噬通量。这两种方法具有高度互补性，可以在许多β细胞模型中评估线粒体质量控制时具有灵活性和精确性。
Introduction
胰腺β细胞产生和分泌胰岛素以满足代谢需求，β细胞功能障碍是 1 型和 2 型糖尿病高血糖和糖尿病发病的原因。β细胞通过线粒体能量和代谢输出将葡萄糖代谢与胰岛素分泌结合，这取决于功能性线粒体质量的储备 1,2,3。为了保持最佳的β细胞功能，β细胞依靠线粒体质量控制机制来去除老化或受损的线粒体并保留功能性线粒体质量4。选择性线粒体自噬，也称为线粒体自噬，是线粒体质量控制途径的关键组成部分。
活细胞中线粒体自噬的评估通常依赖于线粒体自噬期间发生的线粒体 pH 值的变化。线粒体的 pH 值呈微碱性，健康的线粒体通常位于 pH 值中性的胞质溶胶中。在线粒体自噬过程中，受损或功能失调的线粒体被选择性地掺入自噬体中，并最终在酸性溶酶体中清除5.几种体内转基因线粒自噬报告小鼠模型，如 mt-Keima6、mitoQC7 和 CMMR8，以及可转染的线粒自噬探针，如 Cox8-EGFP-mCherry 质粒9，利用这种 pH 变化来提供线粒自噬的定量评估。使用表达 mt-Keima pH 敏感双激发比率探针的转基因小鼠已通过流式细胞术10,11 优化用于胰岛和β细胞的线粒体自噬评估。酸性与中性 mt-Keima 波长发射的比率（酸性 561 nm 与中性 480 nm 激发的比率）可用于稳健地量化线粒体自噬 6,12。
该协议描述了一种优化的方法来评估从mt-Keima转基因小鼠10,11分离的原代胰岛和β细胞中的线粒体自噬通量。虽然 mt-Keima 是一种高度灵敏的探针，但它需要复杂的动物育种方案或细胞转染，这在与其他遗传模型或原代人类胰岛结合使用时通常具有挑战性。此外，使用多种荧光激光器和检测器来识别中性和酸性细胞群可能会限制其他荧光报告基因的组合使用。
为了克服这些挑战，该协议还描述了一种互补的，单荧光通道，基于染料的方法，用于从分离的小鼠胰岛中稳健检测β细胞中的线粒体自噬。这种方法被称为 MtPhagy 方法，它利用三种细胞渗透性染料的组合来选择β细胞，量化积极经历线粒体自噬的细胞群，并同时评估线粒体膜电位（MMP 或 Δψm）。
这些染料中的第一种是 Fluozin-3-AM，这是一种细胞渗透性 Zn2+ 指示剂，Ex/Em 为 494/516 nm13。小鼠胰岛由功能不同的细胞组成异质性细胞群，包括 α、β、δ 和 PP 细胞。β细胞约占小鼠胰岛细胞的 80%，由于其在胰岛素颗粒中的高 Zn2+ 浓度14,15，因此可以与其他胰岛细胞类型区分开来，从而可以将β细胞鉴定为 Fluozin-3-AM高细胞群。MtPhagy 染料是一种 pH 敏感染料，通过化学键固定在线粒体上并发出弱荧光，也用于该协议16。线粒体自噬诱导后，受损的线粒体被掺入酸性溶酶体中，MtPhagy 染料在低 pH 环境 （Ex/Em 561/570-700 nm） 内增加其荧光强度。
此外，四甲基罗丹明乙酯 （TMRE） 用于评估 MMP。TMRE 是一种细胞渗透性带正电荷的染料 （Ex/Em 552/575 nm），由于其膜电位17 所支撑的相对负电荷，它被健康的线粒体隔离。受损或不健康的线粒体会耗散其膜电位，导致螯合 TMRE 的能力降低。将这些染料一起使用，通过流式细胞术可以将进行线粒体自噬的β细胞鉴定为 Fluozin高MtPhagy高TMRE低 群体。由于线粒体自噬是一个动态而不是静态过程，因此该方案进行了优化，以使用缬氨霉素评估线粒体自噬通量，缬氨霉素是一种 K+ 离子载体，可在 MMP18 消散后诱导线粒体自噬。在存在和不存在缬氨霉素的情况下比较线粒体自噬可以评估不同样品组的线粒体自噬通量。
与mt-Keima方案不同，当前方法的基于染料的性质使其可以外推到人类胰岛和其他难以转染的细胞类型，并避免了对复杂动物育种方案的需求。该协议的总体目标是通过两种独立的基于流式细胞术的方法在单细胞水平上量化β细胞中的线粒体自噬。综上所述，该协议描述了两种强大且互补的方法，它们允许在线粒体质量控制的定量研究中具有精确性和灵活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
该协议描述了两种互补的方法来量化解离的原代小鼠胰岛中的线粒体自噬通量。使用 mt-Keima 方法，线粒体自噬的增加被量化为酸性 （561 nm）/中性 （405 nm） 细胞比率的增加，而在 MtPhagy 方法中，线粒体自噬通量的增加被量化为 Fluozin高MtPhagy高TMRE低 细胞群的增加。这些方法可以对线粒体自噬通量进行快速、定量和β细胞特异性评估。
这两种方法都是?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D.感谢 NIH（T32-AI007413 和 T32-AG000114）的支持。SAS 感谢 JDRF （COE-2019-861）、NIH（R01 DK135268、R01 DK108921、R01 DK135032、R01 DK136547、U01 DK127747）、退伍军人事务部 （I01 BX004444）、Brehm 家族和 Anthony 家族的支持。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
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