Complementaire benaderingen om mitofagieflux in pancreas-β-cellen te ondervragen
Summary
Dit protocol schetst twee methoden voor de kwantitatieve analyse van mitofagie in pancreas-β-cellen: ten eerste een combinatie van celdoorlatende mitochondriën-specifieke kleurstoffen en ten tweede een genetisch gecodeerde mitofagie-reporter. Deze twee technieken vullen elkaar aan en kunnen worden ingezet op basis van specifieke behoeften, waardoor flexibiliteit en precisie mogelijk zijn bij het kwantitatief aanpakken van mitochondriale kwaliteitscontrole.
Abstract
Mitofagie is een kwaliteitscontrolemechanisme dat nodig is om een optimale mitochondriale functie te behouden. Disfunctionele β-cel mitofagie resulteert in onvoldoende insulineafgifte. Geavanceerde kwantitatieve beoordelingen van mitofagie vereisen vaak het gebruik van genetische verslaggevers. Het mt-Keima-muismodel, dat een mitochondriën-gerichte pH-gevoelige dual-excitatie ratiometrische sonde uitdrukt voor het kwantificeren van mitofagie via flowcytometrie, is geoptimaliseerd in β-cellen. De verhouding tussen zure en neutrale mt-Keima-golflengte-emissies kan worden gebruikt om mitofagie robuust te kwantificeren. Het gebruik van genetische mitofagieverslaggevers kan echter een uitdaging zijn bij het werken met complexe genetische muismodellen of moeilijk te transfecteren cellen, zoals primaire menselijke eilandjes. Dit protocol beschrijft een nieuwe complementaire, op kleurstof gebaseerde methode om β-celmitofagie in primaire eilandjes te kwantificeren met behulp van MtPhagy. MtPhagy is een pH-gevoelige, celdoorlatende kleurstof die zich ophoopt in de mitochondriën en de fluorescentie-intensiteit verhoogt wanneer mitochondriën zich in omgevingen met een lage pH bevinden, zoals lysosomen tijdens mitofagie. Door de MtPhagy-kleurstof te combineren met Fluozin-3-AM, een Zn2+ -indicator die selecteert voor β-cellen, en Tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE) om het mitochondriale membraanpotentieel te beoordelen, kan mitofagieflux specifiek in β-cellen worden gekwantificeerd via flowcytometrie. Deze twee benaderingen zijn zeer complementair en zorgen voor flexibiliteit en precisie bij het beoordelen van de mitochondriale kwaliteitscontrole in tal van β-celmodellen.
Introduction
Pancreas-β-cellen produceren en scheiden insuline af om aan de metabole eisen te voldoen, en β-celdisfunctie is verantwoordelijk voor hyperglykemie en het ontstaan van diabetes bij zowel type 1- als type 2-diabetes. β-cellen koppelen het glucosemetabolisme aan insulinesecretie via mitochondriale energetica en metabole output, die afhankelijk zijn van een reserve van functionele mitochondriale massa 1,2,3. Om een optimale functie van β cellen te behouden, vertrouwen β-cellen op mitochondriale kwaliteitscontrolemechanismen om verouderde of beschadigde mitochondriën te verwijderen en functionele mitochondrialemassa te behouden. Selectieve mitochondriale autofagie, ook bekend als mitofagie, is een belangrijk onderdeel van de mitochondriale kwaliteitscontroleroute.
Beoordelingen van mitofagie in levende cellen zijn vaak afhankelijk van veranderingen in de mitochondriale pH die optreden tijdens mitofagie. Mitochondriën hebben een licht alkalische pH en gezonde mitochondriën bevinden zich normaal gesproken in het pH-neutrale cytosol. Tijdens mitofagie worden beschadigde of disfunctionele mitochondriën selectief opgenomen in autofagosomen en uiteindelijk opgeruimd in zure lysosomen5. Verschillende in vivo transgene mitofagie-reportermuismodellen, zoals mt-Keima6, mitoQC7 en CMMR8, evenals transfecteerbare mitofagie-sondes, zoals de Cox8-EGFP-mCherry-plasmide9, maken gebruik van deze pH-verandering om kwantitatieve beoordelingen van mitofagie te geven. Het gebruik van transgene muizen die de mt-Keima pH-gevoelige dual-excitatie ratiometrische sonde tot expressie brengen, is geoptimaliseerd voor mitofagiebeoordelingen in eilandjes en β-cellen via flowcytometrie10,11. De verhouding tussen zure en neutrale mt-Keima-golflengte-emissies (de verhouding tussen zure 561 nm en neutrale 480 nm excitatie) kan worden gebruikt om mitofagie 6,12 robuust te kwantificeren.
Dit protocol beschrijft een geoptimaliseerde benadering om mitofagieflux te beoordelen in primaire eilandjes en β-cellen geïsoleerd uit mt-Keima transgene muizen 10,11. Hoewel mt-Keima een zeer gevoelige sonde is, vereist het ofwel gecompliceerde fokprogramma’s voor dieren of de transfectie van cellen, wat vaak een uitdaging kan zijn wanneer het werkt in combinatie met andere genetische modellen of met primaire menselijke eilandjes. Bovendien kan het gebruik van meerdere fluorescentielasers en -detectoren om neutrale en zure celpopulaties te identificeren, het combinatorische gebruik van andere fluorescerende reporters beperken.
Om deze uitdagingen het hoofd te bieden, beschrijft dit protocol ook een aanvullende, op kleurstof gebaseerde methode met één fluorescerend kanaal voor robuuste detectie van mitofagie in β-cellen van geïsoleerde muiseilandjes. Deze benadering, ook wel de MtPhagy-methode genoemd, maakt gebruik van een combinatie van drie celdoorlatende kleurstoffen om β-cellen te selecteren, de celpopulaties te kwantificeren die actief mitofagie ondergaan en tegelijkertijd het mitochondriale membraanpotentieel (MMP of Δψm) te beoordelen.
De eerste van deze kleurstoffen is Fluozin-3-AM, een celdoorlatende Zn2+ indicator met een Ex/Em 494/516 nm13. Muizeneilandjes bestaan uit een heterogene populatie van functioneel verschillende cellen, waaronder α-, β-, δ- en PP-cellen. β-cellen omvatten ongeveer 80% van de cellen in het muiseilandje en kunnen worden onderscheiden van andere eilandjesceltypen door hun hoge Zn2+-concentratie in insulinekorrels14,15, waardoor β-cellen kunnen worden geïdentificeerd als de Fluozin-3-AMhoge populatie. De MtPhagy-kleurstof, een pH-gevoelige kleurstof die via een chemische binding op mitochondriën wordt geïmmobiliseerd en zwakke fluorescentie afgeeft, wordt ook in dit protocol gebruikt16. Bij mitofagie-inductie worden beschadigde mitochondriën opgenomen in het zure lysosoom en verhoogt de MtPhagy-kleurstof de fluorescentie-intensiteit in de omgeving met een lage pH (Ex/Em 561/570-700 nm).
Daarnaast wordt tetramethylrhodamine, ethylester (TMRE), gebruikt om MMP te beoordelen. TMRE is een celdoorlatende positief geladen kleurstof (Ex/Em 552/575 nm) die wordt afgezonderd door gezonde mitochondriën vanwege de relatieve negatieve lading die wordt ondersteund door hun membraanpotentiaal17. Beschadigde of ongezonde mitochondriën verdrijven hun membraanpotentieel, wat resulteert in een verminderd vermogen om TMRE te sekwestreren. Door deze kleurstoffen samen te gebruiken, kunnen β-cellen die mitofagie ondergaan, worden geïdentificeerd als de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage populatie via flowcytometrie. Aangezien mitofagie een dynamisch in plaats van statisch proces is, is dit protocol geoptimaliseerd om mitofagieflux te beoordelen met behulp van valinomycine, een K+-ionofoor die mitofagie induceert na dissipatie van MMP18. Vergelijking van mitofagie in de aan- en afwezigheid van valinomycine maakt het mogelijk om de mitofagieflux in verschillende steekproefgroepen te beoordelen.
Het op kleurstoffen gebaseerde karakter van de huidige aanpak maakt het mogelijk om het te extrapoleren naar menselijke eilandjes en andere moeilijk te transfecten celtypen en omzeilt de noodzaak van gecompliceerde fokprogramma’s voor dieren, in tegenstelling tot het mt-Keima-protocol. Het overkoepelende doel van dit protocol is om mitofagie in β-cellen op het niveau van één cel te kwantificeren via twee onafhankelijke op flowcytometrie gebaseerde methoden. Alles bij elkaar beschrijft dit protocol twee krachtige en complementaire methoden die zowel precisie als flexibiliteit mogelijk maken in de kwantitatieve studie van mitochondriale kwaliteitscontrole.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dit protocol beschreef twee complementaire methoden om mitofagieflux in gedissocieerde primaire muiseilandjes te kwantificeren. Met behulp van de mt-Keima-methode werd een toename van mitofagie gekwantificeerd als een verhoogde verhouding van zure (561 nm)/neutrale (405 nm) cellen, terwijl in de MtPhagy-methode een verhoogde mitofagieflux werd gekwantificeerd als een toename van de FluozinhogeMtPhagyhogeTMRElage celpopulatie. Deze methoden maken snelle, kwantitatieve en β-celspecifieke b…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. erkent de steun van de NIH (T32-AI007413 en T32-AG000114). SAS erkent steun van de JDRF (COE-2019-861), de NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), het Department of Veterans Affairs (I01 BX004444), de familie Brehm en de familie Anthony.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
