膵β細胞におけるマイトファジーフラックスを調べるための補完的アプローチ
Summary
このプロトコルは膵臓のβ細胞のmitophagyの量的な分析のための2つの方法を輪郭を描く: 最初に、細胞透過性のミトコンドリア特定の染料の組合せ、および二番目に、遺伝的にコードされたmitophagyのレポーター。これら2つの手法は補完的であり、特定のニーズに基づいて展開できるため、ミトコンドリアの品質管理に定量的に取り組む際の柔軟性と精度を高めることができます。
Abstract
マイトファジーは、最適なミトコンドリア機能を維持するために必要な品質管理メカニズムです。機能不全のβ細胞マイトファジーは、不十分なインスリン放出をもたらします。マイトファジーの高度な定量的評価には、多くの場合、遺伝子レポーターの使用が必要です。ミトコンドリアを標的としたpH感受性二重励起レシオメトリックプローブを発現し、フローサイトメトリーでマイトファジーを定量化するmt-Keimaマウスモデルは、β細胞で最適化されています。酸性と中性のmt-Keima波長の放射の比率は、マイトファジーを頑健に定量化するために使用できます。しかし、複雑な遺伝子マウスモデルや、初代ヒト膵島などのトランスフェクションが困難な細胞を扱う場合、遺伝的マイトファジーレポーターの使用は困難な場合があります。このプロトコルはMtPhagyを使用して第一次膵島のβ細胞mitophagyを定量化する新しい補足の染料ベースの方法を記述する。MtPhagyは、ミトコンドリアに蓄積し、ミトコンドリアが低pH環境にあるとき(マイトファジー中のリソソームなど)に蛍光強度を増加させる、pH感受性の細胞透過性色素です。MtPhagy 色素を、β細胞を選択する Zn2+ インジケーターであるフルオジン-3-AM、およびミトコンドリア膜電位を評価するためのテトラメチルローダミン、エチルエステル(TMRE)と組み合わせることで、フローサイトメトリーを介してβ細胞内のマイトファジーフラックスを特異的に定量できます。これら2つのアプローチは高度に補完的であり、多数のβ細胞モデルにおけるミトコンドリアの品質管理の評価において柔軟性と精度を可能にします。
Introduction
膵臓のβ細胞は、代謝要求を満たすためにインスリンを産生および分泌し、β細胞機能障害は、1型糖尿病と2型糖尿病の両方で高血糖と糖尿病発症の原因となります。β細胞は、ミトコンドリアのエネルギーと代謝出力を介してグルコース代謝とインスリン分泌を結合し、機能的なミトコンドリア質量の予備力に依存します1,2,3。最適なβ細胞機能を維持するために、β細胞はミトコンドリアの品質管理メカニズムに依存して、老化または損傷したミトコンドリアを除去し、機能的なミトコンドリア質量を維持します4。選択的ミトコンドリアオートファジーは、マイトファジーとも呼ばれ、ミトコンドリア品質管理経路の重要な要素です。
生細胞におけるマイトファジーの評価は、マイトファジー中に起こるミトコンドリアpHの変化に依存することがよくあります。ミトコンドリアのpHはわずかにアルカリ性で、健康なミトコンドリアは通常、pH中性のサイトゾルに存在します。マイトファジーの間、損傷または機能不全のミトコンドリアは選択的にオートファゴソームに取り込まれ、最終的に酸性リソソーム内で除去されます5。mt-Keima6、mitoQC7、CMMR8などのいくつかのin vivoトランスジェニックマイトファジーレポーターマウスモデル、およびCox8-EGFP-mCherryプラスミド9などのトランスフェクタブルマイトファジープローブは、このpH変化を利用してマイトファジーの定量的評価を提供します。mt-Keima pH感受性二重励起レシオメトリックプローブを発現するトランスジェニックマウスの使用は、フローサイトメトリーによる膵島およびβ細胞のマイトファジー評価に最適化されています10,11。酸性から中性へのmt-Keima波長発光の比(561 nmの酸性励起と480 nmの励起に対する酸性の割合)は、マイトファジー6,12の頑健な定量化に用いることができる。
このプロトコルはmtKeimaのtransgenicマウス10,11から隔離される第一次膵島およびβセルのmitophagyの流束を査定するために最大限に活用されたアプローチを記述する。mt-Keimaは高感度プローブですが、複雑な動物育種スキームや細胞のトランスフェクションが必要であり、他の遺伝子モデルや初代ヒト膵島と組み合わせて作業する場合、困難な場合があります。さらに、中性細胞集団と酸性細胞集団を同定するために複数の蛍光レーザーと検出器を使用することで、他の蛍光レポーターのコンビナトリアル使用を制限することができます。
これらの課題を克服するために、このプロトコルでは、孤立したマウス膵島からのβ細胞のマイトファジーを強力に検出するための補完的な単一の蛍光チャネル、色素ベースの方法も説明します。MtPhagy法と呼ばれるこのアプローチは、3つの細胞透過性色素の組み合わせを利用して、β細胞を選択し、マイトファジーを活発に受けている細胞集団を定量し、ミトコンドリア膜電位(MMPまたはΔψm)を同時に評価します。
これらの色素の最初のものは、Ex/Em 494/516 nm13を有する細胞透過性Zn2+指示薬であるFluozin-3-AMです。マウス膵島は、α細胞、β細胞、δ細胞、PP細胞など、機能的に異なる細胞の不均一な集団で構成されています。β細胞はマウス膵島内の細胞の約80%を占め、インスリン顆粒内のZn2+濃度が高いため、他の膵島細胞タイプと区別することができ14,15、フルオジン-3-AMの高集団としてβ細胞の同定を可能にします。化学結合を介してミトコンドリアに固定化され、弱い蛍光を発するpH感受性染料であるMtPhagy色素もこのプロトコルで利用されています16。マイトファジー誘導により、損傷したミトコンドリアが酸性リソソームに取り込まれ、MtPhagy色素は低pH環境(Ex/Em 561/570-700 nm)内で蛍光強度を増加させます。
さらに、テトラメチルローダミン、エチルエステル(TMRE)は、MMPの評価に使用されます。TMREは細胞透過性の正電荷を帯びた色素(Ex/Em 552/575 nm)であり、膜電位によって維持される相対的な負電荷により、健康なミトコンドリアによって隔離される17。損傷したミトコンドリアや不健康なミトコンドリアは、膜電位を消散させ、TMREを隔離する能力を低下させます。これらの色素を併用すると、マイトファジーを起こしているβ細胞は、フローサイトメトリーによってフルオジン高MtPhagy高TMRE低集団として識別できます。マイトファジーは静的プロセスではなく動的プロセスであるため、このプロトコルは、MMP18の消散後にマイトファジーを誘導するK +-イオノフォアであるバリノマイシンを使用してマイトファジーフラックスを評価するように最適化されました。バリノマイシンの存在下と非存在下でのマイトファジーの比較により、異なるサンプルグループにおけるマイトファジーフラックスの評価が可能になります。
現在のアプローチは色素ベースの性質を持っているため、ヒト膵島やその他のトランスフェクションが困難な細胞タイプに外挿することができ、mt-Keimaプロトコルとは異なり、複雑な動物育種スキームの必要性を回避します。このプロトコルの包括的な目標は、2つの独立したフローサイトメトリーベースの方法を介して、単一細胞レベルでβ細胞のマイトファジーを定量化することです。まとめると、このプロトコルは、ミトコンドリアの品質管理の定量的研究における精度と柔軟性の両方を可能にする2つの強力で補完的な方法を説明しています。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、分離された一次マウス膵島のマイトファジーフラックスを定量化する2つの補完的な方法を説明しました。mt-Keima法では、マイトファジーの増加は酸性(561 nm)/中性(405 nm)細胞の比率の増加として定量化され、MtPhagy法では、マイトファジーフラックスの増加は、フルオジン高MtPhagy高TMRE低細胞集団の増加として定量化されました。これらの方法により?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D.さんNIH(T32-AI007413およびT32-AG000114)からの支援を認める。SASは、JDRF(COE-2019-861)、NIH(R01 DK135268、R01 DK108921、R01 DK135032、R01 DK136547、U01 DK127747)、退役軍人省(I01 BX004444)、Brehmファミリー、Anthonyファミリーからの支援に感謝しています。
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
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