Enfoques complementarios para interrogar el flujo de mitofagia en las células β pancreáticas
Summary
Este protocolo describe dos métodos para el análisis cuantitativo de la mitofagia en las células β pancreáticas: en primer lugar, una combinación de colorantes específicos de mitocondrias permeables a las células y, en segundo lugar, un indicador de mitofagia codificado genéticamente. Estas dos técnicas son complementarias y pueden implementarse en función de necesidades específicas, lo que permite flexibilidad y precisión para abordar cuantitativamente el control de calidad mitocondrial.
Abstract
La mitofagia es un mecanismo de control de calidad necesario para mantener una función mitocondrial óptima. La mitofagia disfuncional de las células β da como resultado una liberación insuficiente de insulina. Las evaluaciones cuantitativas avanzadas de la mitofagia a menudo requieren el uso de indicadores genéticos. El modelo de ratón mt-Keima, que expresa una sonda radiométrica de doble excitación sensible al pH dirigida a las mitocondrias para cuantificar la mitofagia mediante citometría de flujo, se ha optimizado en células β. La relación entre las emisiones de longitud de onda de mt-Keima ácidas y neutras se puede utilizar para cuantificar de forma robusta la mitofagia. Sin embargo, el uso de reporteros genéticos de mitofagia puede ser un desafío cuando se trabaja con modelos genéticos complejos de ratones o células difíciles de transfectar, como los islotes humanos primarios. Este protocolo describe un nuevo método complementario basado en colorantes para cuantificar la mitofagia de células β en islotes primarios mediante MtPhagy. MtPhagy es un colorante sensible al pH y permeable a las células que se acumula en las mitocondrias y aumenta su intensidad de fluorescencia cuando las mitocondrias se encuentran en entornos de pH bajo, como los lisosomas durante la mitofagia. Al combinar el colorante MtPhagy con Fluozin-3-AM, un indicador de Zn2+ que selecciona para las células β, y tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE) para evaluar el potencial de la membrana mitocondrial, el flujo de mitofagia se puede cuantificar específicamente en las células β mediante citometría de flujo. Estos dos enfoques son altamente complementarios, lo que permite flexibilidad y precisión en la evaluación del control de calidad mitocondrial en numerosos modelos de células β.
Introduction
Las células β pancreáticas producen y secretan insulina para satisfacer las demandas metabólicas, y la disfunción de las células β es responsable de la hiperglucemia y la aparición de diabetes tanto en la diabetes tipo 1 como en la diabetes tipo 2. Las células β acoplan el metabolismo de la glucosa con la secreción de insulina a través de la energía mitocondrial y la producción metabólica, que dependen de una reserva de masa mitocondrial funcional 1,2,3. Para mantener una función óptima de las células β, las células β dependen de los mecanismos de control de calidad mitocondrial para eliminar las mitocondrias envejecidas o dañadas y preservarla masa mitocondrial funcional. La autofagia mitocondrial selectiva, también conocida como mitofagia, es un componente clave de la vía de control de calidad mitocondrial.
Las evaluaciones de la mitofagia en células vivas a menudo se basan en los cambios en el pH mitocondrial que ocurren durante la mitofagia. Las mitocondrias tienen un pH ligeramente alcalino, y las mitocondrias sanas normalmente residen en el citosol de pH neutro. Durante la mitofagia, las mitocondrias dañadas o disfuncionales se incorporan selectivamente a los autofagosomas y, finalmente, se eliminan dentro de los lisosomas ácidos5. Varios modelos de ratones reporteros de mitofagia transgénica in vivo, como mt-Keima6, mitoQC7 y CMMR8, así como sondas de mitofagia transfectables, como el plásmido Cox8-EGFP-mCherry9, utilizan este cambio de pH para proporcionar evaluaciones cuantitativas de la mitofagia. El uso de ratones transgénicos que expresan la sonda radiométrica de doble excitación sensible al pH mt-Keima se ha optimizado para las evaluaciones de mitofagia en islotes y células β mediante citometría de flujo10,11. La relación entre las emisiones de longitud de onda mt-Keima ácidas y neutras (la relación entre la excitación ácida de 561 nm y la neutra de 480 nm) puede utilizarse para cuantificar de forma robusta la mitofagia 6,12.
Este protocolo describe un enfoque optimizado para evaluar el flujo mitofagia en islotes primarios y células β aisladas de ratones transgénicos mt-Keima10,11. Si bien mt-Keima es una sonda altamente sensible, requiere complicados esquemas de cría de animales o la transfección de células, lo que a menudo puede ser un desafío cuando se trabaja en combinación con otros modelos genéticos o con islotes humanos primarios. Además, el uso de múltiples láseres y detectores de fluorescencia para identificar poblaciones celulares neutras y ácidas puede limitar el uso combinatorio de otros reporteros fluorescentes.
Para superar estos desafíos, este protocolo también describe un método complementario, basado en colorantes de un solo canal fluorescente, para la detección robusta de mitofagia en células β de islotes de ratón aislados. Este enfoque, conocido como el método MtPhagy, utiliza una combinación de tres colorantes permeables a las células para seleccionar las células β, cuantificar las poblaciones celulares que se someten activamente a la mitofagia y evaluar el potencial de membrana mitocondrial (MMP o Δψm) simultáneamente.
El primero de estos colorantes es Fluozin-3-AM, un indicador de Zn2+ permeable a las células con un Ex/Em 494/516 nm13. Los islotes de ratón comprenden una población heterogénea de células funcionalmente distintas, incluidas las células α, β, δ y PP. Las células β comprenden aproximadamente el 80% de las células dentro del islote de ratón y se pueden distinguir de otros tipos de células de islotes debido a su alta concentración de Zn2+ dentro de los gránulos de insulina14,15, lo que permite la identificación de las células β como laalta población de Fluozin-3-AM. El colorante MtPhagy, un colorante sensible al pH que se inmoviliza en las mitocondrias a través de un enlace químico y emite fluorescencia débil, también se utiliza en este protocolo16. Tras la inducción de la mitofagia, las mitocondrias dañadas se incorporan al lisosoma ácido, y el colorante MtPhagy aumenta su intensidad de fluorescencia en el entorno de pH bajo (Ex/Em 561/570-700 nm).
Además, la tetrametilrodamina, éster etílico (TMRE), se utiliza para evaluar la MMP. TMRE es un colorante permeable a las células con carga positiva (Ex/Em 552/575 nm) que es secuestrado por las mitocondrias sanas debido a la carga negativa relativa sostenida por su potencial de membrana17. Las mitocondrias dañadas o poco saludables disipan su potencial de membrana, lo que resulta en una disminución de la capacidad para secuestrar TMRE. Utilizando estos colorantes juntos, las células de β que se someten a mitofagia se pueden identificar como la poblaciónaltade Fluozin MtPhagyaltaTMREbaja a través de la citometría de flujo. Dado que la mitofagia es un proceso dinámico y no estático, este protocolo se optimizó para evaluar el flujo de mitofagia utilizando valinomicina, un ionóforo de K+ que induce la mitofagia después de la disipación de MMP18. La comparación de la mitofagia en presencia y ausencia de valinomicina permite evaluar el flujo de mitofagia en diferentes grupos de muestras.
La naturaleza basada en colorantes del enfoque actual permite extrapolarlo a islotes humanos y otros tipos de células difíciles de transfectar y evita la necesidad de complicados esquemas de cría de animales, a diferencia del protocolo mt-Keima. El objetivo general de este protocolo es cuantificar la mitofagia en células β a nivel de una sola célula a través de dos métodos independientes basados en citometría de flujo. En conjunto, este protocolo describe dos métodos potentes y complementarios que permiten tanto precisión como flexibilidad en el estudio cuantitativo del control de calidad mitocondrial.
Protocol
Representative Results
Discussion
Este protocolo describe dos métodos complementarios para cuantificar el flujo mitofagia en islotes primarios disociados de ratón. Utilizando el método mt-Keima, un aumento en la mitofagia se cuantificó como un aumento de la proporción de células ácidas (561 nm)/neutras (405 nm), mientras que en el método MtPhagy, el aumento del flujo de mitofagia se cuantificó como un aumento en la población de célulasbajas de FluozinaltaMtPhagyaltaTMRE. Estos métodos permiten realizar evaluac…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. agradece el apoyo de los NIH (T32-AI007413 y T32-AG000114). SAS agradece el apoyo de la JDRF (COE-2019-861), los NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), el Departamento de Asuntos de Veteranos (I01 BX004444), la familia Brehm y la familia Anthony.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
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