Pankreas β Hücrelerinde Mitofaji Akısını Sorgulamak İçin Tamamlayıcı Yaklaşımlar
Summary
Bu protokol, pankreas β hücrelerinde mitofajinin kantitatif analizi için iki yöntemi özetlemektedir: birincisi, hücre geçirgen mitokondriye özgü boyaların bir kombinasyonu ve ikincisi, genetik olarak kodlanmış bir mitofaji raporlayıcısı. Bu iki teknik tamamlayıcıdır ve belirli ihtiyaçlara göre konuşlandırılabilir, bu da mitokondriyal kalite kontrolünün nicel olarak ele alınmasında esneklik ve kesinlik sağlar.
Abstract
Mitofaji, optimal mitokondriyal fonksiyonu sürdürmek için gerekli bir kalite kontrol mekanizmasıdır. Disfonksiyonel β hücreli mitofaji, yetersiz insülin salınımına neden olur. Mitofajinin gelişmiş kantitatif değerlendirmeleri genellikle genetik raportörlerin kullanılmasını gerektirir. Akış sitometrisi yoluyla mitofajiyi ölçmek için mitokondri hedefli pH’a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu ifade eden mt-Keima fare modeli, β hücrelerde optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı, mitofajiyi sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir. Bununla birlikte, karmaşık genetik fare modelleri veya birincil insan adacıkları gibi transfekte edilmesi zor hücrelerle çalışırken genetik mitofaji raportörlerini kullanmak zor olabilir. Bu protokol, MtFagy kullanarak birincil adacıklarda β hücreli mitofajiyi ölçmek için yeni bir tamamlayıcı boya bazlı yöntemi açıklar. MtFagy, mitokondride biriken ve mitofaji sırasında lizozomlar gibi mitokondri düşük pH’lı ortamlarda olduğunda floresan yoğunluğunu artıran, pH’a duyarlı, hücre geçirgen bir boyadır. MtFagy boyasını, β hücrelerini seçen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-ve mitokondriyal membran potansiyelini değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) ile birleştirerek, mitofaji akısı, akış sitometrisi yoluyla β hücrelerde spesifik olarak ölçülebilir. Bu iki yaklaşım oldukça tamamlayıcıdır ve çok sayıda β hücreli modelde mitokondriyal kalite kontrolünün değerlendirilmesinde esneklik ve kesinlik sağlar.
Introduction
Pankreas β hücreleri, metabolik talepleri karşılamak için insülin üretir ve salgılar ve β hücre disfonksiyonu, hem tip 1 hem de tip 2 diyabette hiperglisemi ve diyabet başlangıcından sorumludur. β-Hücreler, fonksiyonel mitokondriyal kütlerezervine bağlı olan mitokondriyal enerji ve metabolik çıktı yoluyla glikoz metabolizmasını insülin sekresyonu ile birleştirir 1,2,3. Optimal β hücre fonksiyonunu sürdürmek için, β hücreleri, yaşlı veya hasarlı mitokondriyi uzaklaştırmak ve fonksiyonel mitokondriyal kütleyi korumak için mitokondriyal kalite kontrol mekanizmalarına güvenir4. Mitofaji olarak da bilinen seçici mitokondriyal otofaji, mitokondriyal kalite kontrol yolunun önemli bir bileşenidir.
Canlı hücrelerde mitofaji değerlendirmeleri genellikle mitofaji sırasında meydana gelen mitokondriyal pH’daki değişikliklere dayanır. Mitokondri hafif alkali bir pH’a sahiptir ve sağlıklı mitokondri normalde pH-nötr sitozolde bulunur. Mitofaji sırasında, hasarlı veya işlevsiz mitokondri seçici olarak otofagozomlara dahil edilir ve sonunda asidik lizozomlar5 içinde temizlenir. mt-Keima6, mitoQC7 ve CMMR8 gibi birkaç in vivo transgenik mitofaji raportör fare modelinin yanı sıra Cox8-EGFP-mCherry plazmid9 gibi transfekte edilebilir mitofaji probları, mitofajinin kantitatif değerlendirmelerini sağlamak için bu pH değişimini kullanır. mt-Keima pH’a duyarlı çift uyarma oranı metrik probunu eksprese eden transgenik farelerin kullanımı, akış sitometrisi10,11 yoluyla adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji değerlendirmeleri için optimize edilmiştir. Asidik-nötr mt-Keima dalga boyu emisyonlarının oranı (asidik 561 nm’nin nötr 480 nm uyarıma oranı) mitofajiyi 6,12 sağlam bir şekilde ölçmek için kullanılabilir.
Bu protokol, mt-Keima transgenik farelerinden izole edilen primer adacıklarda ve β hücrelerinde mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiş bir yaklaşımı açıklar10,11. mt-Keima oldukça hassas bir prob olsa da, ya karmaşık hayvan yetiştirme şemaları ya da hücrelerin transfeksiyonunu gerektirir, bu da diğer genetik modellerle veya birincil insan adacıklarıyla birlikte çalışırken genellikle zor olabilir. Ek olarak, nötr ve asidik hücre popülasyonlarını tanımlamak için çoklu floresan lazerlerin ve dedektörlerin kullanılması, diğer floresan raportörlerin kombinatoryal kullanımını sınırlayabilir.
Bu zorlukların üstesinden gelmek için, bu protokol aynı zamanda izole fare adacıklarından β hücrelerinde mitofajinin sağlam tespiti için tamamlayıcı, tek floresan kanallı, boya bazlı bir yöntemi de açıklar. MtFagy yöntemi olarak adlandırılan bu yaklaşım, β hücrelerini seçmek, aktif olarak mitofaji geçiren hücre popülasyonlarını ölçmek ve aynı anda mitokondriyal membran potansiyelini (MMP veya Δψm) değerlendirmek için üç hücre geçirgen boyanın bir kombinasyonunu kullanır.
Bu boyalardan ilki, Ex/Em 494/516 nm13’e sahip hücre geçirgen bir Zn2+ göstergesi olan Fluozin-3-‘dir. Fare adacıkları, α, β, δ- ve PP hücreleri dahil olmak üzere işlevsel olarak farklı hücrelerden oluşan heterojen bir popülasyon içerir. β-Hücreleri, fare adacığı içindeki hücrelerin yaklaşık% 80’ini oluşturur ve insülin granülleri14,15 içindeki yüksek Zn2+ konsantrasyonları nedeniyle diğer adacık hücre tiplerinden ayırt edilebilir, bu da β hücrelerinin Fluozin-3-yüksek popülasyonu olarak tanımlanmasına izin verir. Kimyasal bir bağ yoluyla mitokondri üzerinde hareketsiz hale getirilen ve zayıf floresan yayan pH’a duyarlı bir boya olan MtPhagy boyası da bu protokoldekullanılmaktadır 16. Mitofaji indüksiyonu üzerine, hasarlı mitokondri asidik lizozoma dahil edilir ve MtFagy boyası, düşük pH ortamında (Ex/Em 561/570-700 nm) floresan yoğunluğunu arttırır.
Ek olarak, MMP’yi değerlendirmek için Tetrametilrodamin, etil ester (TMRE) kullanılır. TMRE, membran potansiyeli 17 tarafından desteklenen nispi negatif yük nedeniyle sağlıklı mitokondri tarafından tutulan, hücre geçirgen pozitif yüklü bir boyadır (Ex/Em552/575 nm). Hasarlı veya sağlıksız mitokondri, membran potansiyellerini dağıtır ve bu da TMRE’yi ayırma yeteneğinin azalmasına neden olur. Bu boyalar birlikte kullanıldığında, mitofajiye uğrayan β hücreleri, akış sitometrisi yoluyla FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük popülasyonu olarak tanımlanabilir. Mitofaji statik bir süreçten ziyade dinamik bir süreç olduğundan, bu protokol, MMP18’in dağılmasını takiben mitofajiyi indükleyen bir K+-iyonofor olan valinomisin kullanılarak mitofaji akısını değerlendirmek için optimize edilmiştir. Valinomisin varlığında ve yokluğunda mitofajinin karşılaştırılması, farklı örneklem gruplarında mitofaji akısının değerlendirilmesine olanak tanır.
Mevcut yaklaşımın boya bazlı doğası, insan adacıklarına ve diğer transfekte edilmesi zor hücre tiplerine tahmin edilmesine izin verir ve mt-Keima protokolünün aksine karmaşık hayvan yetiştirme şemalarına olan ihtiyacı ortadan kaldırır. Bu protokolün genel amacı, iki bağımsız akış sitometrisi tabanlı yöntemle tek hücre düzeyinde β hücrelerde mitofajiyi ölçmektir. Birlikte ele alındığında, bu protokol, mitokondriyal kalite kontrolünün kantitatif çalışmasında hem kesinlik hem de esneklik sağlayan iki güçlü ve tamamlayıcı yöntemi açıklar.
Protocol
Representative Results
Discussion
Bu protokol, ayrışmış primer fare adacıklarında mitofaji akısını ölçmek için iki tamamlayıcı yöntemi tanımladı. Mt-Keima yöntemi kullanılarak, mitofajideki bir artış, asidik (561 nm) / nötr (405 nm) hücrelerin oranının artması olarak ölçülürken, MtFaji yönteminde, artan mitofaji akısı, FluozinyüksekMtFajiyüksekTMREdüşük hücre popülasyonunda bir artış olarak ölçüldü. Bu yöntemler, mitofaji akısının hızlı, kantitatif ve β hücreye özgü …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
E.L-D. NIH’den (T32-AI007413 ve T32-AG000114) destek alır. SAS, JDRF (COE-2019-861), NIH (R01 DK135268, R01 DK108921, R01 DK135032, R01 DK136547, U01 DK127747), Gazi İşleri Bakanlığı (I01 BX004444), Brehm ailesi ve Anthony ailesi.
Materials
| Antibiotic-Antimycotic | Life Technologies | 15240-062 | |
| Attune NxT Flow Cytometer | Thermofisher Scientific | A24858 | |
| DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) | Thermofisher Scientific | D1306 | DAPI reconstituted in ddH2O to reach 0.2 µg/mL stock |
| Dimethyl Sulfoxide | Sigma-Aldrich | 317275 | |
| Fatty Acid Free heat shock BSA powder | Equitech | BAH66 | |
| Fetal bovine serum | Gemini Bio | 900-108 | |
| Fluozin-3AM | Thermofisher Scientific | F24195 | 100 μg Fluozin-3AM powder reconstituted in 51 μL DMSO and 51 μL Pluronic F-127 to reach 1 mM stock. |
| Gibco RPMI 1640 Medium | Fisher Scientific | 11-875-093 | |
| HEPES (1M) | Life Technologies | 15630-080 | |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| MtPhagy dye | Dojindo | MT02-10 | |
| Penicillin-Streptomycin (100x) | Life Technologies | 15140-122 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Phosphate buffered saline, 10x | Fisher Scientific | BP399-20 | 1x Solution used in procotol by diluting 1:10 in ddH2O |
| Sodium Pyruvate (100x) | Life Technologies | 11360-070 | 5 μg MtPhagy powder reconstituted with 50 μL DMSO to reach 100 μM stock. |
| TMRE [Tetramethylrhodamine, ethyl ester, perchlorate] | Anaspec | AS-88061 | TMRE powder reconstituted in DMSO to reach 100 μM stock. |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermofisher Scientific | 25300054 | |
| Valinomycin | Sigma | V0627 | Valinomycin powder reconsituted in DMSO to reach 250 nM stock. |
References
- Kaufman, B. A., Li, C., Soleimanpour, S. A. Mitochondrial regulation of β-cell function: maintaining the momentum for insulin release. Molecular Aspects of Medicine. 42, 91-104 (2015).
- Soleimanpour, S. A., et al. The diabetes susceptibility gene Clec16a regulates mitophagy. Cell. 157 (7), 1577-1590 (2014).
- Pearson, G., et al. Clec16a, Nrdp1, and USP8 form a ubiquitin-dependent tripartite complex that regulates β-cell mitophagy. Diabetes. 67 (2), 265-277 (2018).
- Hattori, N., Saiki, S., Imai, Y. Regulation by mitophagy. International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 53, 147-150 (2014).
- Berezhnov, A. V., et al. Intracellular pH modulates autophagy and mitophagy. Journal of Biological Chemistry. 291 (16), 8701-8708 (2016).
- Sun, N., et al. Measuring in vivo mitophagy. Molecular Cell. 60 (4), 685-696 (2015).
- McWilliams, T. G., et al. mito-QC illuminates mitophagy and mitochondrial architecture in vivo. Journal of Cell Biology. 214 (3), 333-345 (2016).
- Aoyagi, K., et al. A new beta cell-specific mitophagy reporter mouse shows that metabolic stress leads to accumulation of dysfunctional mitochondria despite increased mitophagy. Diabetologia. 66 (1), 147-162 (2023).
- Ma, X., Ding, W. X. A fluorescence imaging based-assay to monitor mitophagy in cultured hepatocytes and mouse liver. Liver Research. 5 (1), 16-20 (2021).
- Sidarala, V., et al. Mitophagy protects β cells from inflammatory damage in diabetes. JCI Insight. 5 (24), 141138 (2020).
- Gingerich, M. A., et al. An intrinsically disordered protein region encoded by the human disease gene CLEC16A regulates mitophagy. Autophagy. 19 (2), 525-543 (2023).
- Sun, N., Malide, D., Liu, J., Rovira, I. I., Combs, C. A., Finkel, T. A fluorescence-based imaging method to measure in vitro and in vivo mitophagy using mt-Keima. Nature Protocols. 12 (8), 1576-1587 (2017).
- Zhao, J., Bertoglio, B. A., Gee, K. R., Kay, A. R. The zinc indicator FluoZin-3 is not perturbed significantly by physiological levels of calcium or magnesium. Cell Calcium. 44 (4), 422-426 (2008).
- Da Silva Xavier, G. The Cells of the Islets of Langerhans. Journal of Clinical Medicine. 7 (3), 54 (2018).
- Thapa, B., et al. Imaging β-cell function using a zinc-responsive MRI contrast agent may identify first responder islets. Frontiers in Endocrinology. 12, 809867 (2022).
- Iwashita, H., et al. Live cell imaging of mitochondrial autophagy with a novel fluorescent small molecule. ACS Chemical Biology. 12 (10), 2546-2551 (2017).
- Crowley, L. C., Christensen, M. E., Waterhouse, N. J. Measuring mitochondrial transmembrane potential by TMRE staining. Cold Spring Harbor Protocols. 2016 (12), 087361 (2016).
- Klein, B., Wörndl, K., Lütz-Meindl, U., Kerschbaum, H. H. Perturbation of intracellular K(+) homeostasis with valinomycin promotes cell death by mitochondrial swelling and autophagic processes. Apoptosis. 16 (11), 1101-1117 (2011).
- Ji, Y., et al. Toll-like receptors TLR2 and TLR4 block the replication of pancreatic β cells in diet-induced obesity. Nature Immunology. 20 (6), 677-686 (2019).
- Sauvat, A., et al. Quantification of cellular viability by automated microscopy and flow cytometry. Oncotarget. 6 (11), 9467-9475 (2015).
- Liu, Y. T., et al. Mt-Keima detects PINK1-PRKN mitophagy in vivo with greater sensitivity than mito-QC. Autophagy. 17 (11), 3753-3762 (2021).
- Mauro-Lizcano, M., et al. New method to assess mitophagy flux by flow cytometry. Autophagy. 11 (5), 833-843 (2015).
