Multiomics-Analyse von TMEM200A als Pan-Cancer-Biomarker
Summary
Hier wird ein Protokoll vorgestellt, in dem mehrere bioinformatische Werkzeuge kombiniert werden, um die biologischen Funktionen von TMEM200A bei Krebs zu untersuchen. Darüber hinaus validieren wir die bioinformatischen Vorhersagen auch experimentell.
Abstract
Es ist bekannt, dass das Transmembranprotein TMEM200A mit menschlichen Krebserkrankungen und Immuninfiltration in Verbindung gebracht wird. Hier untersuchten wir die Funktion von TMEM200A bei häufigen Krebserkrankungen mittels Multiomics-Analyse und verwendeten in vitro Zellkulturen von Magenzellen, um die Ergebnisse zu verifizieren. Die Expression von TMEM200A in verschiedenen menschlichen Krebsarten wurde anhand der RNA-seq-Daten aus der UCSC Xena-Datenbank untersucht. Die bioinformatische Analyse ergab eine mögliche Rolle von TMEM200A als diagnostischer und prognostischer Biomarker.
Es wurden Kulturen von normalen Magen- und Krebszelllinien gezüchtet und TMEM200A wurde niedergeschlagen. Die Expressionsniveaus von TMEM200A wurden mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion und Western Blot gemessen. In vitro Loss-of-Function-Studien wurden dann verwendet, um die Rolle von TMEM200A beim malignen Verhalten und der Tumorbildung von Magenkrebszellen (GC) zu bestimmen. Western Blots wurden verwendet, um die Wirkung des Knockdowns auf den epithelial-mesenchymalen Übergang (EMT) und den PI3K/AKT-Signalweg in der GC zu untersuchen. Bioinformatische Analysen zeigten, dass TMEM200A in hohen Konzentrationen in GC exprimiert wurde.
Die Proliferation von GC-Zellen wurde durch TMEM200A Knockdown gehemmt, der auch Vimentin-, N-Cadherin- und Snai-Proteine verringerte und die AKT-Phosphorylierung hemmte. Der PI3K/AKT-Signalweg schien ebenfalls an der TMEM200A-vermittelten Regulation der GC-Entwicklung beteiligt zu sein. Die hier vorgestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass TMEM200A die Mikroumgebung des Tumors reguliert, indem es die EMT beeinflusst. TMEM200A kann auch die EMT durch PI3K/AKT-Signale beeinflussen und so die Mikroumgebung des Tumors beeinflussen. Daher kann TMEM200A bei Pankarzinomen, insbesondere GC, ein potenzieller Biomarker und ein Onkogen sein.
Introduction
Krebs hat sich aufgrund seiner weltweit hohen Morbiditäts- und Mortalitätsraten zu einem anhaltendenProblem der öffentlichen Gesundheit entwickelt, das die menschliche Gesundheit weltweit gefährdet 1 und eine schwere finanzielle und medizinische Belastung für die Gesellschaft darstellt2. In den letzten Jahren wurden dank der Entdeckung von Krebsmarkern3 bedeutende Fortschritte in der Krebstherapie erzielt, und Forscher haben neuartige Diagnosemethoden und neue Medikamente zur Behandlung von Krebs entwickelt. Einige Patienten mit Krebs haben jedoch aufgrund von Faktoren wie Medikamentenresistenz, Nebenwirkungen von Medikamenten und Chemikalienempfindlichkeit immer noch schlechte Prognosen4. Daher besteht ein dringender Bedarf an der Identifizierung neuer Biomarker für das Screening und die Behandlung von Krebserkrankungen im Frühstadium5.
Membranproteine sind Proteine, die sich an Zellen und Organellenmembranen binden und integrieren können6. Diese können je nach Stärke der Bindung an die Membran und ihrer Lage in drei Kategorien eingeteilt werden: lipidverankerte Proteine, integrale Proteine und periphere Membranproteine 7,8. Ein Transmembranprotein (TMEM) ist ein integrales Membranprotein, das aus mindestens einem Transmembransegment9 besteht, das entweder ganz oder teilweise durch die biologische Membran verläuft.
Obwohl die Wirkmechanismen der Proteine der TMEM-Familie nicht gut verstanden sind, ist bekannt, dass diese Proteine an verschiedenen Krebsarten beteiligt sind10. Mehrere TMEM-Proteine sind mit migratorischen, proliferativen und invasiven Phänotypen assoziiert, und ihre Expression ist oft mit der Prognose eines Patienten verbunden11. Daher sind Mitglieder der TMEM-Familie zum Ziel der Forschung geworden. Eine umfassende Überprüfung bestehender Berichte über TMEM ergab, dass sie hauptsächlich mit inter- und intrazellulärer Signalübertragung12, immunbedingten Erkrankungen und Tumorgenese10 assoziiert sind. Viele TMEMs besitzen auch wichtige physiologische Funktionen, z. B. Ionenkanäle in der Plasmamembran, die Aktivierung von Signaltransduktionswegen sowie die Vermittlung von Zellchemotaxis, Adhäsion, Apoptose und Autophagie10. Daher stellten wir die Hypothese auf, dass TMEM-Proteine wichtige prognostische Marker bei der Erkennung und Behandlung von Tumoren sein könnten.
TMEM200A Expression ist bei Magenkrebs (GC) signifikant erhöht. Eine höhere Expression von TMEM200A13, das acht Exons und eine Gesamtlänge von 77,536 kb auf Chromosom 6q23.1 aufweist, wurde mit einer schlechten Prognose für das Gesamtüberleben (OS) bei GC in Verbindung gebracht. Dennoch wurden die Veränderungen in seiner Expression in onkologischen Studien nur selten berichtet. Dieser Artikel vergleicht und analysiert die Nützlichkeit von TMEM200A als therapeutisches Ziel und tumordiagnostischer Marker in verschiedenen Krebsstudien unter Verwendung verschiedener öffentlich zugänglicher Datensätze. Wir untersuchten die Wirksamkeit von TMEM200A als diagnostischer und prognostischer Biomarker für Krebserkrankungen sowie seine Expressionsniveaus bei verschiedenen menschlichen Krebsarten mit Hilfe von RNA-seq-Daten aus den UCSC-Xena- und TCGA-Datenbanken sowie mittels quantitativer Echtzeit-Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) und Western Blotting.
Der Einfluss TMEM200A Expressionsniveaus auf Mutationsraten , regulatorische Prozesse, Tumordiagnose und -prognose, Immuninfiltration und Immuntherapie wurde mit einer Mischung aus Computerwerkzeugen und Datensatz-Websites weiter untersucht. CBioPortal und die COSMIC-Datenbanken (Catalog of Somatic Mutations in Cancer Cells) wurden verwendet, um Mutationen in TMEM200A zu untersuchen. Sangerbox- und TISIDB-Websites wurden verwendet, um zu verstehen, wie TMEM200A die Immuninfiltration beeinflusst. Mit dem Online-Tool des Tumor Immune Single Cell Center (TISCH) und der Datenbank CancerSEA wurde die Funktion von TMEM200A untersucht. Um den Einfluss von TMEM200A auf das maligne Verhalten und die Tumorentwicklungsfunktion von GC-Zellen zu untersuchen, wurde schließlich ein Loss-of-Function-Experiment in einem In-vitro-Assay durchgeführt. Zusätzlich wurde ein Western Blot durchgeführt, um zu beurteilen , wie sich TMEM200A Knockdown auf den PI3K/AKT-Signalweg und die epithelial-mesenchymale Transition (EMT) bei GC auswirkt.
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A gehört zu einer Familie von TMEMs, die für die Vermehrung von Krebszellen unerlässlich sind38. Die variable Expression von TMEM200A bei verschiedenen Malignomen hat weniger Aufmerksamkeit erhalten, und es fehlt an einer gründlichen Untersuchung von Krebserkrankungen. Es häufen sich jedoch weiterhin Hinweise darauf, dass die TMEM-Transmembranproteinfamilie wichtig sein kann, um Krebszellen durch Wechselwirkungen mit mehreren Proteinen bösartig zu halten, z. B. förd…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde von der National Natural Science Foundation of China (82160550) unterstützt.
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
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