汎がんバイオマーカーとしての TMEM200A のマルチオミクス解析
Summary
ここでは、複数のバイオインフォマティクスツールを組み合わせて、がんにおける TMEM200A の生物学的機能を研究するプロトコルを紹介します。さらに、バイオインフォマティクスの予測を実験的に検証します。
Abstract
膜貫通型タンパク質 TMEM200Aは、ヒトのがんや免疫浸潤に関与することが知られています。ここでは、一般的ながんにおける TMEM200A の機能をマルチオミクス解析により評価し、胃細胞の in vitro 細胞培養を用いて検証しました。いくつかのヒトがんにおける TMEM200A の発現は、UCSC XenaデータベースのRNA-seqデータを用いて評価された。バイオインフォマティクス解析により、診断および予後バイオマーカーとしての TMEM200A の潜在的な役割が明らかになりました。
正常な胃細胞株および癌細胞株の培養物を増殖させ、 TMEM200A ノックダウンした。 TMEM200A の発現レベルは、定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応およびウェスタンブロッティングを用いて測定した。次に、 in vitro 機能喪失試験を使用して、胃がん(GC)細胞の悪性挙動および腫瘍形成における TMEM200A の役割を決定しました。ウェスタンブロットを使用して、GCの上皮間葉転換(EMT)およびPI3K/AKTシグナル伝達経路に対するノックダウンの影響を評価しました。バイオインフォマティクス解析により 、TMEM200A はGCで高レベルで発現していることが示されました。
GC細胞の増殖は TMEM200A ノックダウンによって阻害され、ビメンチン、N-カドヘリン、およびSnaiタンパク質も減少し、AKTリン酸化が阻害されました。PI3K/AKTシグナル伝達経路は、 GC発生のTMEM200Aを介した制御にも関与しているようである。ここで提示された結果は 、TMEM200A がEMTに影響を与えることによって腫瘍微小環境を調節していることを示唆しています。 TMEM200A は、PI3K/AKTシグナル伝達を介してEMTにも影響を与え、腫瘍微小環境に影響を与える可能性があります。したがって、汎がん、特にGCでは、 TMEM200A 潜在的なバイオマーカーおよびがん遺伝子である可能性があります。
Introduction
がんは、世界的に高い罹患率と死亡率により、世界的に人々の健康を危険にさらす永続的な公衆衛生問題として浮上しており1、社会に大きな経済的および医学的負担をもたらしています2。近年、がんマーカーの発見3により、がん治療は大きく進歩し、研究者はがんを治療するための新しい診断法や新薬を開発しています。しかし、がん患者の中には、薬剤耐性、薬剤の副作用、化学物質過敏症などの要因により、依然として予後不良な患者もいます4。したがって、早期がんのスクリーニングと治療のための新しいバイオマーカーを特定することが急務となっています5。
膜タンパク質は、細胞や細胞小器官膜に結合して統合できるタンパク質です6。これらは、膜への結合の強さとその位置に応じて、脂質アンカータンパク質、内在性タンパク質、および末梢膜タンパク質の3つのカテゴリに分類できます7,8。膜貫通型(TMEM)タンパク質は、少なくとも1つの膜貫通セグメント9からなる内在性膜タンパク質であり、このセグメントは生体膜を完全または部分的に通過する。
TMEMファミリーに属するタンパク質の作用機序はよくわかっていないが、これらのタンパク質はいくつかの種類のがんに関与していることが知られている10。いくつかのTMEMタンパク質は、遊走性、増殖性、および侵襲性の表現型と関連しており、それらの発現はしばしば患者の予後と関連しています11。そのため、TMEMファミリーのメンバーが研究対象となっています。TMEMに関する既存の報告を包括的に検討したところ、TMEMは主に細胞間および細胞内のシグナル伝達12、免疫関連疾患、および腫瘍形成10に関連していることが明らかになりました。多くのTMEMは、細胞膜のイオンチャネル、シグナル伝達経路の活性化、細胞走化性、接着、アポトーシス、オートファジーの媒介など、重要な生理学的機能も備えています10。したがって、TMEMタンパク質は腫瘍の検出と治療における重要な予後マーカーである可能性があるという仮説を立てました。
胃 がん(GC)ではTMEM200A発現が有意に上昇します。染色体6q23.1上に8つのエクソンと77.536 kbの全長を有する TMEM200A13の発現が高いことは、GC症例の全生存(OS)の予後不良と関連している。しかし、その発現の変化は、腫瘍学研究でほとんど報告されていません。本稿では、公開されているさまざまなデータセットを用いて、さまざまながん研究における治療標的および腫瘍診断マーカーとしての TMEM200A の有用性を比較・分析する。UCSC XenaおよびTCGAデータベースのRNA-seqデータ、リアルタイム定量的ポリメラーゼ連鎖反応(qRT-PCR)、ウェスタンブロッティングを用いて、汎がん診断および予後バイオマーカーとしての TMEM200A の有効性、およびさまざまなヒトがん種における発現レベルを評価しました。
TMEM200A発現レベルが突然変異率、調節プロセス、腫瘍の診断と予後、免疫浸潤、および免疫療法に及ぼす影響を、計算ツールとデータセットのウェブサイトを組み合わせてさらに調査した。CBioPortalおよびCatalog of Somatic Mutations in Cancer Cells(COSMIC)データベースを使用して、TMEM200Aの変異を調べました。SangerboxとTISIDBのウェブサイトは、TMEM200Aが免疫浸潤にどのように影響するかを理解するために利用されました。Tumor Immune Single Cell Center(TISCH)のオンラインツールとCancerSEAデータベースを使用して、TMEM200Aの機能を調査しました。最後に、GC細胞の悪性挙動および腫瘍発生機能に対するTMEM200Aの影響を評価するために、in vitroアッセイで機能喪失実験を実施しました。さらに、ウェスタンブロッティングを実施して、ノックダウンTMEM200A PI3K/AKTシグナル伝達経路およびGCの上皮間葉転換(EMT)にどのように影響するかを評価しました。
Protocol
Representative Results
Discussion
TMEM200A 、がん細胞の増殖に不可欠なTMEMファミリーに属しています38。異なる悪性腫瘍における TMEM200A の発現のばらつきはあまり注目されておらず、徹底的な汎がん調査は行われていない。しかし、TMEM膜貫通タンパク質ファミリーは、いくつかのタンパク質との相互作用を通じてがん細胞を悪性に保つのに重要である可能性があることを示す証拠が蓄積され続?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
この研究は、中国国家自然科学基金会(82160550)の支援を受けました。
Materials
| Anti-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 60203-2-Ig | |
| Anti-E-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 20874-1-AP | |
| anti-glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase (GAPDH) antibody | Proteintech Group, Inc | 10494-1-AP | |
| Anti-N-cadherin antibody | Proteintech Group, Inc | 22018-1-AP | |
| Anti-P-AKT antibody | Proteintech Group, Inc | 66444-1-Ig | |
| Anti-snail antibody | Proteintech Group, Inc | 13099-1-AP | |
| Anti-Vimentin antibody | Proteintech Group, Inc | 10366-1-AP | |
| AxyPrepMultisourceTotalRNAMini- prep Kit |
Suzhou Youyi Landi Biotechnology Co., Ltd | UEL-UE-MN-MS-RNA-50G | |
| BCA Protein Assay Kit | Epizyme Biotech | ZJ101L | |
| CCK-8 reagent | MedChemExpress | HY-K0301-500T | |
| Fetal bovine serum (FBS) | CYAGEN BIOSCIENCES (GUANGZHOU) INC | FBSSR-01021 | |
| GAPDH primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): TGACATCAAGAAGGTG GTGAAGCAG; Reverse primer (5’-3’): GTGTCGCTGTTGAAG TCAGAGGAG |
|
| HighGene plus Transfection reagent | ABclonal | RM09014P | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-1 | |
| HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit lgG (H+L) | Proteintech Group, Inc | SA00001-2 | |
| Human gastric mucosal epithelial GES-1 cells | Guangzhou Cellcook Biotech Co.,Ltd. | ||
| Human STAD HGC-27 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| Human STAD SGC-7901 cells | Procell Life Science&Technology Co.,Ltd | ||
| MonAmp SYBR Green qPCR Mix (None ROX) | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MQ10101S | |
| MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase | Mona (Suzhou) Biotechnology Co., Ltd | MR05101M | |
| Omni-ECL Femto Light Chemiluminescence Kit | Epizyme Biotech | SQ201 | |
| PAGE Gel Fast Preparationb Kit | Epizyme Biotech | PG111 | |
| Penicillin-streptomycin (Pen-Strep) | Beijing Solarbio Science & Technology Co.,Ltd | P1400-100 | |
| Polyvinylidene difluoride (PVDF) membrane | Merck KGaA | IPVH00010-1 | |
| Protein Free Rapid Blocking Buffer | Epizyme Biotech | PS108P | |
| RIPA lysis solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | R0010 | |
| RPMI 1640 complete medium | Thermo Fisher Scientific | C11875500BT | |
| Skimmed milk | Campina: Elk | ||
| TBST buffer solution | Beijing Solarbio Science & Technology Co., Ltd | T1082 | |
| The protein loading buffer | Epizyme Biotech | LT101S | |
| TMEM200A knockdown plasmid | MiaoLing Plasmid | ||
| TMEM200A primer | Sangon Biotech (Shanghai) Co., Ltd. | Forward primer (5’-3’): AAGGCGGTGTGGTGGTTCG; Reverse primer (5’-3’): GATTTTGGTCTCTTTGTCACGGTT | |
| TMEM200A SiRNA1 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACTGATGATAAGACCAG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGACTACTATTCTGGTC | |
| TMEM200A SiRNA2 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): CGTGTGAATGTCAATGACTG; Reverse primer (5’-3’): GCACACTTACAGTTACTGAC | |
| TMEM200A SiRNA3 | MiaoLing Plasmid | Forward primer (5’-3’): ACAACCACAACATCTGCCCG; Reverse primer (5’-3’): TGTTGGTGTTGTAGACGGGC | |
| Transmembrane protein 200A Antibody | Proteintech Group, Inc | 48081-1 | |
| Equipment | |||
| CO2 cell culture incubator | Haier Group | PYXE-80IR | |
| Electrophoresis instrument | Bio-RAD | ||
| Fluorescence quantitative PCR instrument | Bio-RAD | ||
| Gel Imaging System (Tanon 5200) | Tanon Science & Technology Co., Ltd | LAB-0002-0007-SHTN | |
| Multifunctional Enzyme Labeler | Berthold |
References
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