Denne protokol præsenterer en integreret biorepository-platform til standardiseret indsamling, annotering og biobanking af høj kvalitet human vandig humor og glasagtige flydende biopsier til molekylære downstream-analyser, herunder proteomics, metabolomics og glycomics.
En kritisk udfordring i translationel forskning er at etablere en levedygtig og effektiv grænseflade mellem patientpleje på operationsstuen (OR) og forskningslaboratoriet. Her udviklede vi en protokol til anskaffelse af flydende biopsier af høj kvalitet til molekylære analyser fra den vandige humor og glaslegemet fra patienter, der gennemgår øjenkirurgi. I denne arbejdsgang bruges en Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) vogn udstyret med en computer, en stregkodescanner og laboratorieinstrumenter, herunder køleopbevaring ombord, til at indhente og arkivere humane biologiske prøver. En webbaseret database, der overholder databeskyttelsen, gør det muligt at annotere hver prøve i løbet af dens levetid, og et kartesisk koordinatsystem gør det muligt at spore hver stregkodet prøve i opbevaring, hvilket muliggør hurtig og nøjagtig hentning af prøver til downstream-analyser. Molekylær karakterisering af humane vævsprøver tjener ikke kun som et diagnostisk værktøj (fx at skelne mellem infektiøs endophthalmitis og anden ikke-infektiøs intraokulær inflammation), men repræsenterer også en vigtig komponent i translationel forskning, der muliggør identifikation af nye lægemiddelmål, udvikling af nye diagnostiske værktøjer og personlig terapi.
Molekylær profilering af flydende biopsier fra det menneskelige øje kan fange lokalt berigede væsker indeholdende molekyler som DNA, RNA, proteiner, glycaner og metabolitter fra højt specialiserede okulære væv. Flydende biopsier fra glaslegemet i det bageste kammer i det menneskelige øje viste sig at være en generelt sikker procedure1. De tillader molekylær karakterisering af okulære sygdomme hos levende mennesker og giver potentialet til at identificere nye diagnostiske og terapeutiske strategier 2,3,4. Den vandige humor i øjets forreste kammer har endnu højere kirurgisk tilgængelighed og kunne opnås i stort antal, f.eks. under grå stær kirurgi, som er en af de hyppigst udførte operationer. Imidlertid er der ingen standardiseret protokol til indsamling, annotering og biobanking af human vandig humor og glasagtige flydende biopsier til molekylære nedstrømsanalyser, herunder proteomics, metabolomics og glycomics, tilgængelig indtil nu.
Her udviklede vi en protokol til indsamling og biobank af flydende biopsier af høj kvalitet til molekylære analyser fra patienter, der gennemgår øjenoperationer. En Mobile Operating Room Lab Interface (MORLI) gør det muligt for en forsker straks at snapfryse de indsamlede prøver i stregkodede kryoer på tøris ved -80 °C i operationsstuen (OR). Denne procedure sikrer en høj og konsistent prøvekvalitet til downstream molekylær analyse. Ud over fremragende prøvekvalitet er nøjagtig annotering af prøver i en biobank kritisk. Ved hjælp af en webbaseret HIPAA (Health Insurance Portability and Accountability Act) -kompatibel REDCap (forskning elektronisk datafangst)database 5 tillader vores arbejdsgang lagring af detaljerede metadata for hver prøve, herunder alder, køn, sygdom, sygdomsstadium, prøvetype og unikke funktioner i operationen. Dette vil muliggøre nøjagtig fremtidig søgekapacitet, f.eks. efter prøver fra en bestemt sygdom eller en bestemt patientgruppe. Derudover arkiveres den nøjagtige placering af hver prøve i fryseren ved hjælp af et kartesisk gittersystem, som muliggør effektiv prøvehentning til downstream-eksperimenter. Vi viser eksempler på DNA-, protein-, glykan- og metabolitanalyser.
Vores arbejdsgang repræsenterer en praktisk og effektiv forbindelse mellem operationsstuen og forskningslaboratoriet og giver et værdifuldt grundlag for translationel forskning.
Kirurgiske prøver fra patienter tillader direkte molekylær karakterisering af sygdom hos levende mennesker 2,3,4,14 og kan hjælpe med at overvinde begrænsningerne i celle- og dyresygdomsmodeller, der ikke fuldt ud rekapitulerer menneskelig sygdom 15,16. Molekylær analyse af humant væv kan forbedre udvælgelsen af nye lægemiddelmål og kan bidrage til en højere succesrate for kliniske forsøg og lægemiddelgodkendelse17. Derudover giver denne tilgang potentialet for personlig medicin, da det opnåede væv bevarer det unikke genomiske, epigenomiske, metabolomiske, glycomiske og proteomiske fingeraftryk af hver enkelt person 2,18,19.
Høj og ensartet prøvekvalitet er grundlæggende for alle molekylære analyseapplikationer. Tidligere undersøgelser har vist, at øjeblikkelig frysning efter prøveudtagning og undgåelse af gentagne fryse-/optøningscyklusser er afgørende for høje prøvekvaliteter 9,20. Langtidsopbevaring over flere år ved -70 °C påvirkede ikke signifikant integriteten af den proteomiske profil9. En standardiseret protokol er et vigtigt fundament for at reducere bias og forbedre sammenligneligheden af videnskabelige data, især når flere personer (kirurger, teknikere og andre) eller forskellige institutioner er involveret i prøveudtagningsprocessen. Bortset fra prøvekvaliteten er annotering af prøver en anden vigtig faktor, der kræver standardisering for at muliggøre korrelation af molekylære fund med kliniske data. Vores protokol er afhængig af tre væsentlige principper for at opnå dette: 1) en standardiseret prøveudtagningsprocedure for vandig humor og glasagtige flydende biopsier af en øjenkirurg, 2) øjeblikkelig behandling og snapfrysning af prøver i operationsstuen af laboratoriepersonale og 3) en metadataannotering af hver prøve i en webbaseret database, der giver forskere mulighed for hurtigt at finde prøver til senere eksperimenter.
Ud over glasagtige prøver20 etablerer denne arbejdsgang også den standardiserede samling af vandige humor flydende biopsier til molekylær analyse. Den vandige humor er en meget tilgængelig, kompleks væske i øjets forreste kammer, der ikke kun afspejler okulære sygdomme i det forreste, men også i det bageste segment af øjet, herunder retinal sygdom18,21. Sammen med det faktum, at et stort antal vandige humorprøver kunne indsamles, f.eks. under grå stær-kirurgi, en af de hyppigst udførte operationer på verdensplan, gør disse funktioner det til en interessant kilde til flydende biopsier fra det menneskelige øje. Den standardiserede metadataannotering for hver prøve, der er etableret i denne arbejdsgang, kan også muliggøre korrelation af proteomdata med potentielle kliniske opfølgningsdata. Dette giver en spændende mulighed for at identificere nye prognostiske biomarkører, som kan hjælpe med at estimere prognosen for fremtidige patienter.
Imidlertid har molekylær analyse af humane kirurgiske prøver også vigtige begrænsninger. For eksempel er komplekse eksperimentelle manipulationer ofte kun mulige i dyre- og cellemodeller. En løsning kan være at sammenligne dyre- eller cellemodellers molekylære profil med den humane sygdomsprofil. Denne strategi kan identificere overlappende proteinbiomarkører og terapeutiske mål, der kan valideres i dyr eller cellemodeller for at identificere de mest lovende kandidater, der korrelerer med menneskelig sygdom og sandsynligvis vil lykkes i kliniske forsøg 4,16.
Afslutningsvis etablerer vores arbejdsgang en praktisk grænseflade mellem operationsstuen og forskningslaboratoriet, der muliggør standardiseret og høj gennemstrømningsindsamling, annotering og opbevaring af kirurgiske prøver af høj kvalitet til molekylær downstream-analyse, hvilket giver et værdifuldt fundament for fremtidig translationel forskning.
The authors have nothing to disclose.
VBM støttes af NIH-bevillinger (R01EY031952, R01EY031360, R01EY030151 og P30EY026877), Stanford Center for Optic Disc Drusen og Research to Prevent Blindness, New York, USA. JW og DR er støttet af VitreoRetinal Surgery Foundation, USA. DR er støttet af DARE Fellowship, som er støttet af Lundbeckfonden.
0.5ml Tri-coded Tube, 96-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 68-0703-12 | used for aqueous humor samples |
1 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
1.9ml Tri-coded Tube, 48-format, External Thread | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-7643 | used for vitreous samples |
3 mL syringe | surgical grade, whatever available in hospital | – | for vitreous biopsies |
30-32-gauge needle | surgical grade, whatever available in hospital | – | for aqueous humor biopsies |
Capillary electrophoresis coupled with Fourier transformed mass spectrometry (CE-FTMS) | Human Metabolome Technologies, Inc., Tsuruoka, Japan | – | – |
Constellation vitrectomy system with 23-, 25-, or 27-gauge trocar cannula system | Alcon Laboratories Inc, Fort Worth, TX, USA | – | for vitreous biopsies |
Cooling box | Standard styrofoam box, whatever available in lab | – | – |
Dry ice | Whatever available in lab | – | – |
Handsfree Standard Range Scanner Kit with Shielded USB Cable | Zebra Symbol | DS9208-SR4NNU21Z | Barcode scanner |
Human Glycosylation Antibody Array L3 | RayBiotech, Peachtree Corners, GA, USA | GAH-GCM-L3 | – |
Mac mini | Apple Inc., Cupertino, CA 95014, USA | – | – |
MetaboAnalyst software | Pang et al., 2021, PMID: 34019663 | – | – |
Rack for 0.5ml tubes, 96-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 66-51026 | for aqueous humor samples |
Rack for 1.9ml tubes, 48-Format | Azenta Life Sciences, Burlington, MA 01803, USA | 65-9451 | for vitreous samples |
REDCap browser-based sample database | REDCap Consortium, Vanderbilt University, https://www.project-redcap.org | – | – |