Здесь мы опишем собственный анализ активности фактора внеклеточной везикулярной ткани. Анализы, основанные на активности, и анализы на основе антигенов были использованы для измерения тканевого фактора во внеклеточных везикулах из образцов плазмы крови человека. Анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов.
Тканевый фактор (ТФ) является трансмембранным рецептором для факторов (F) VII и FVIIa. Комплекс TF/FVIIa инициирует коагуляционный каскад, активируя как FIX, так и FX. ТФ высвобождается из клеток в кровоток в виде внеклеточных везикул (ВВ). Уровень ТФ-положительных (+) ВВ повышен при различных заболеваниях, включая онкологические, бактериальные и вирусные инфекции, цирроз печени, и связан с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и летальностью. Существует два способа измерения ТФ+ ВВ в плазме: анализ на основе антигена и анализ на основе активности. Данные свидетельствуют о том, что анализы, основанные на активности, обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем анализы на основе антигенов. В этом документе описывается наш собственный анализ активности EVTF, основанный на двухступенчатом анализе генерации FXa. FVIIa, FX и кальций добавляют к образцам, содержащим ТФ+ EV, для генерации FXa в присутствии и отсутствии антител к ТФ, чтобы отличить ТФ-зависимую генерацию FXa от TF-независимой генерации FXa. Для определения уровня FXa используется хромогенный субстрат, расщепленный FXa, в то время как стандартная кривая, сгенерированная с помощью релипированного рекомбинантного TF, используется для определения концентрации TF. Этот собственный анализ активности ЭВТФ обладает более высокой чувствительностью и специфичностью, чем коммерческий анализ активности ТФ.
Свертывание крови начинается со связывания фактора (F) VII/VIIa с тканевым фактором (TF)1. Комплекс TF/FVIIa активирует как FIX, так и FX для активации свертывания крови1. Существует две формы полноразмерного мембранного ТФ: зашифрованный и активный. Кроме того, существует альтернативно сплайсированная форма ТФ (asTF). Сфингомиелин и фосфатидилхолин в наружной створке клеточной мембраны поддерживают ТФ в зашифрованном состоянии 2,3,4. Когда клетки активируются или повреждаются, фосфолипидная скрамблаза переносит фосфатидилсерин и другие отрицательно заряженные фосфолипиды на внешнюю створку1. Активация клеток также приводит к транслокации кислой сфингомиелиназы на внешнюю створку, где она разлагает сфингомиелин до церамида5. Эти два механизма преобразуют зашифрованный TF в активную форму. Также предполагается, что белковая дисульфидизомераза опосредует образование дисульфидных связей между Cys186 и Cys209 в зашифрованном ТФ, что приводит к расшифровке ТФ 6,7,8. asTF также присутствует в кровотоке, но у него отсутствует трансмембранный домен, и поэтому он растворим 9,10. Важно отметить, что asTF имеет очень низкий уровень прокоагулянтной активности по сравнению с полноразмерным активным TF10,11.
Внеклеточные везикулы (ВВ) высвобождаются из покоящихся, активированных и умирающих клеток хозяина, а также из раковых клеток12. ВВ экспрессируют белки из родительских клеток12. Активные ТФ-содержащие ВВ высвобождаются из активированных моноцитов, эндотелиальных клеток и опухолевых клеток в кровоток 13,14,15. Уровни ТФ в плазме могут быть измерены с помощью анализов активности и антигенов. Анализы на основе антигенов включают ИФА и проточную цитометрию16. Существует два различных анализа активности: одноэтапный и двухэтапный анализ активности ТФ. Одноэтапный анализ основан на анализе свертывания крови на основе плазмы. Образец, содержащий ТФ, добавляют в плазму и измеряют время образования сгустка после повторной кальцификации. Двухступенчатый анализ измеряет генерацию образцов FXa путем добавления FVII или FVIIa, FX и кальция. Уровни FXa определяются с помощью субстрата, который расщепляется FXa.
Как в одностадийном, так и в двухступенчатом анализе активности ТФ концентрация ТФ определяется с помощью стандартной кривой, полученной с помощью рекомбинантного ТФ. Двухэтапные анализы обладают более высокой чувствительностью и специфичностью, чем одностадийные. Многие исследования подтвердили, что анализы, основанные на активности, имеют более высокую чувствительность и специфичность, чем анализы на основе антигенов 17,18,19,20,21. Кроме того, наш собственный анализ активности имеет более высокую чувствительность и специфичность, чем анализ коммерческой деятельности22. Здоровые люди имеют очень низкие или неопределяемые уровни активности ЭВТФ в плазме. Напротив, лица с патологическими состояниями, такими как рак, цирроз печени, сепсис и вирусная инфекция, имеют обнаруживаемые уровни активности ЭВТФ, и это связано с тромбозом, диссеминированным внутрисосудистым свертыванием, тяжестью заболевания и смертностью 23,24,25,26,27,28. В этой статье мы опишем этот собственный двухступенчатый анализ активности EVTF.
Здесь представлен протокол нашего собственного анализа активности ЭВТФ. Протокол состоит из трех важнейших этапов. При восстановлении гранулы EV важно проводить пипеткой вверх и вниз в том месте, где находится гранула EV, даже если она не видна. Неполное восстановление гранулы EV приведе?…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана R35HL155657 NIH NHLBI (Нью-Мексико) и профессором Джона С. Паркера (Нью-Мексико). Мы хотели бы поблагодарить г-жу Сьерру Арчибальд за ее полезные комментарии
1.5 mL tube for 20,000 x g centrifuge | any company | N/A | We use the one from Fisher Scientific (Catalog number: 05-408-129). |
1.5 mL tube for ultracentrifuge | any company | N/A | We use the one from Beckman Coulter (Catalog number: 357448) |
15 mL tube | any company | N/A | We use the one from VWR (Catalog number: 89039-666) |
21 G x .75 in. BD Vacutainer Safety-Lok Blood Collection Set with 12 in. tubing and luer adapter | BD | 367281 | |
96-well plate | any company | N/A | We use the one from Globe Scientific (Catalog number: 120338). |
BD Vacutainer Citrate Tubes | BD | 363083 | |
Bovine serum albumin | Sigma Aldrich | A9418 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | C69-500 | |
Centrifuge for 1.5 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5417R (Eppendorf). |
Centrifuge for 15 mL tube | any company | N/A | We use the Centrifuge 5810R (Eppendorf). |
D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7021 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid tetrasodium salt dihydrate | Sigma Aldrich | E6511 | |
Hepes | Sigma Aldrich | H4034 | |
Human FVIIa | Enzyme Research Laboratory | HFVIIa | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Human FX | Enzyme Research Laboratory | HFX1010 | The solution should be diluted with HBSA-Ca(+). |
Inhibitory mouse anti-human tissue factor IgG, clone HTF-1 | Fisher Scientific | 550252 | |
Lipopolysaccharide from Escherichia coli O111:B4 | Sigma Aldrich | L2630 | There are several lipopolysaccharide from different E. coli. Different lipopolysaccharide have different potential to activate monocytes. |
Mouse IgG | Sigma Aldrich | I5381 | |
Pefachrome FXa 8595 | Enzyme Research Laboratory | 085-27 | |
Plate reader | any company | N/A | We use the SpectraMax i3x from Molecular Devices |
Re-lipidated recombinant tissue factor, Dade Innovin | Siemens | 10873566 | |
Sodium chloride | Fisher Scientific | S271-500 | |
Ultracentrifuge | Beckman Coulter | Optima TLX | |
Ultracentrifuge rotor | Beckman Coulter | TLA-55 |