פציעת הקפאה בשריר המסה של עכבר להקמת מודל פיברוזיס שריר הלסת
Summary
מטרת פרוטוקול זה היא לבסס מודל פיברוזיס שרירי הפנים. השוואת ההיסטולוגיה בין מעסה עכברים לשריר הקדמי טיביאליס לאחר פציעה קפואה אישרה פיברוזיס שריר המעסה. מודל זה יאפשר חקירה נוספת של המנגנון העומד בבסיס פיברוזיס שריר הפנים.
Abstract
שריר הלסת מהווה תת-קבוצה של רקמת שריר השלד, עם מסלול אבולוציוני מובהק ומקור התפתחותי. בניגוד לשרירי הגפיים שמקורם בסומיט, שרירי הלסת מקורם בקשתות הענפיות, עם תרומות בלעדיות מהפסגה העצבית הגולגולתית. מחקר שנערך לאחרונה גילה כי התחדשות שונה גם בקבוצת שרירי הפנים. עם זאת, מנגנון הרגולציה הבסיסי עדיין לא נחשף. המודלים הנוכחיים להתחדשות שרירי השלד מתמקדים בעיקר בשרירי הגפיים והגו. בפרוטוקול זה, קרח יבש שימש לגרימת פציעת הקפאה בשריר המסה של העכבר ובשריר הטיביאליס הקדמי ליצירת מודל פיברוזיס של שריר הפנים. הדינמיקה הטמפורלית של תאי לוויין שריר ואבות פיברו-אדיפוגניים הייתה שונה בין שני השרירים, מה שהוביל לפגיעה בהתחדשות מיופייבר ולשקיעת מטריצה חוץ-תאית מוגזמת. בעזרת מודל זה, מחקר מעמיק יותר של התחדשות שרירים באזור orofacial יכול להתבצע כדי לפתח גישות טיפוליות עבור חולים עם מחלות orofacial .
Introduction
שרירי הלסת הם קריטיים בפעילויות פיזיולוגיות יומיומיות כגון מסטיקציה, דיבור, נשימה והבעות פנים1. עם זאת, בעיוותים אורופציאליים מולדים, שרירים אלה מפגינים שינויים אטרופיים ופיברוטיים, מה שמוביל לפגיעה בבריאות הגוף ובקוגניציה חברתית2. ניתוח שחזור פנים נותר טיפול הקו הראשון, אך עד 30-70% מהמטופלים לאחר הניתוח עדיין סובלים מאובדן שרירים ותפקוד לקוי של שרירים 3,4 כישלון התחדשות שריר הלסת מיוחס לגורמים פנימיים, שאינם ניתנים לתיקון על ידי ניתוח בלבד.
הופעתם של שרירי הלסת היא חידוש אבולוציוני, המלווה את ראש החוליות המורכב והלב הקאמרי 5,6. שלא כמו עמיתיהם הגפיים שמקורם בסומיט, שרירי הלסת מקורם בקשת הענפית7. תווים פילוגנטיים ואונטוגנטיים אלה עשויים לגרום להם להתנהגויות רגנרטיביות מובחנות8. דווח כי שריר המעסה (MAS) פיתח פיברוזיס חמור בזמן ששריר הטיביאליס הקדמי (TA) התחדש במלואו לאחר חשיפה באותה מידה של פציעה 1,9. עם זאת, המנגנון הבסיסי של התחדשות נותר מובן היטב.
במחקר זה נקבע מודל פציעה מקפיא של שריר המסה של עכברים כדי להקל על חקירת התחדשות שרירי הפנים. בחרנו 14 יום לאחר הפציעה כנקודת הזמן להערכת פנוטיפ פיברוזיס מכיוון שזו הייתה נקודת הזמן המוקדמת ביותר שבה ניתן היה להבחין בסטייה בין שני שרירים. התחדשות מלאה של MAS לאחר פציעה דורשת לפחות 40 שבועות1. באופן עקבי, מחקר זה גילה שקיעת קולגן יוצאת דופן לאחר פציעה קפואה של MAS בהשוואה להתחדשות רגילה של TA לאחר 14 יום לאחר הפציעה. בעזרת מודל זה ניתן לבצע מחקרים מכניסטיים נוספים על ניוון שרירים ופיברוזיס, אשר בתורו יסייעו בפיתוח דרכים טיפוליות פוטנציאליות לקידום התחדשות שרירי הלסת לאחר הניתוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
ישנם מגוון מודלים של פציעות לחקר התחדשות שרירי השלד, כולל שימוש בגירויים פיזיים, כימיים וכירורגיים 10,11,12,13,14,15,16. קרדיוטוקסין ובריום כלוריד הם שני הכימיקלים הנפו?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
מחקר זה נתמך על ידי מענקים מוועדת הבריאות והבריאות המחוזית של סצ’ואן (מספר מענק: 21PJ063) והקרן הלאומית למדעי הטבע של סין (מספר מענק: 82001031).
Materials
| 1 mL syringe | Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China) | 1-ml syringe | / |
| Acetone | Chron Chemicals | Aceton | / |
| Adhesion microscope slides | Citotest Scientific | 188105 | / |
| Animal depilatory | Phygene Scientific | PH1877 | / |
| BSA (bovine serum albumin) | Solarbio Life Sciences | A8010 | / |
| DAPI | Solarbio Life Sciences | C0065 | / |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150129 | 1:200 |
| donkey serum | Solarbio Life Sciences | SL050 | / |
| Dry Ice | Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) | rice-shaped dry ice | / |
| IFKine Red Donkey anti-rabbit | Abbkine Scientific Company | A24421 | 1:200 |
| Insulation barrels (big) | Thermos | D600 | / |
| Insulation barrels (small) | Polar Ware | 250B | / |
| Isoflurane | RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China) | R510-22 | / |
| Isopentane | MACKLIN | M813375 | / |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | 1:1000 |
| Liquid nitrogen | Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) | / | / |
| M.O.M kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Mice | Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China) | 5 weeks old | / |
| mounting medium | Solarbio Life Sciences | S2100 | / |
| Nertral balsam | Solarbio Life Sciences | G8590 | / |
| Pax7 | Developmental Studies Hybridoma Bank | Pax7 | 1:5 |
| Pdgfra | R&D systems | AF1062 | 1:40 |
| Sirus Red Staining Kit | Solarbio Life Sciences | G1472 | / |
| Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture) | Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China) | / | / |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | / |
| Triton | Shanghai Scigrace Biotech | ABIO-Biofroxx-0006A | / |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 50 | / |
References
- Yoshioka, K., Kitajima, Y., Seko, D., Tsuchiya, Y., Ono, Y. The body region specificity in murine models of muscle regeneration and atrophy. Acta Physiologica. 231 (1), e13553 (2021).
- Worley, M. L., Patel, K. G., Kilpatrick, L. A. Cleft lip and palate. Clinics in Perinatology. 45 (4), 661-678 (2018).
- Pai, B. C. J., Hung, Y. -. T., Wang, R. S. H., Lo, L. -. J. Outcome of patients with complete unilateral cleft lip and palate: 20-year follow-up of a treatment protocol. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 359e-367e (2019).
- Parsaei, Y., Chandler, L., Smetona, J. T., Lopez, J., Steinbacher, D. Aesthetic repair of unilateral cleft lip using the modified inferior triangle and adjunctive techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (1), 70e-73e (2022).
- Schubert, F. R., Singh, A. J., Afoyalan, O., Kioussi, C., Dietrich, S. To roll the eyes and snap a bite – function, development and evolution of craniofacial muscles. Seminars In Cell & Developmental Biology. 91, 31-44 (2019).
- Vyas, B., Nandkishore, N., Sambasivan, R. Vertebrate cranial mesoderm: developmental trajectory and evolutionary origin. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (10), 1933-1945 (2020).
- Sambasivan, R., Kuratani, S., Tajbakhsh, S. An eye on the head: the development and evolution of craniofacial muscles. Development. 138 (12), 2401-2415 (2011).
- Cheng, X., et al. Head muscle fibro-adipogenic progenitors account for the tilted regeneration towards fibrosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 589, 131-138 (2022).
- Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Developmental Dynamics. 212 (4), 495-508 (1998).
- Camacho-Alonso, F., et al. Regeneration of lingual musculature in rats using myoblasts over porcine bladder acellular matrix. Oral Diseases. 27 (6), 1580-1589 (2021).
- LeBoff, M. S., et al. The clinician’s guide to prevention and treatment of osteoporosis. Osteoporosis International. 33 (10), 2049-2102 (2022).
- Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nature Communications. 12 (1), 2860 (2021).
- Mahdy, M. A. A. Glycerol-induced injury as a new model of muscle regeneration. Cell and Tissue Research. 374 (2), 233-241 (2018).
- Guardiola, O., et al. Induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), 54515 (2017).
- Larouche, J. A., Wallace, E. C., Spence, B. D., Buras, E., Aguilar, C. A. Spatiotemporal mapping of immune and stem cell dysregulation after volumetric muscle loss. JCI Insight. 8 (7), e162835 (2023).
- Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Engineering. Part C, Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446.e7 (2019).
- Dong, J., Dong, Y., Chen, Z., Mitch, W. E., Zhang, L. The pathway to muscle fibrosis depends on myostatin stimulating the differentiation of fibro/adipogenic progenitor cells in chronic kidney disease. Kidney International. 91 (1), 119-128 (2017).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: the social network. Frontiers In Physiology. 10, 1074 (2019).
