口腔顔面筋線維症モデルを確立するためのマウス咬筋の凍結損傷
Summary
このプロトコルの目標は、口腔顔面筋線維症モデルを確立することです。凍結傷害後のマウス咬筋と前脛骨筋の組織型の比較により、咬筋線維症が確認された。このモデルは、口腔顔面筋線維症の根底にあるメカニズムのさらなる調査を容易にします。
Abstract
口腔顔面筋は骨格筋組織のサブセットを構成し、明確な進化の軌跡と発達の起源を持っています。体節由来の四肢筋とは異なり、口腔顔面筋は分枝弓に由来し、脳神経堤が排他的に寄与しています。最近の研究では、口腔顔面筋群でも再生が異なることが明らかになりました。しかし、その根底にある規制メカニズムは、まだ解明されていません。現在の骨格筋再生モデルは、主に手足と体幹の筋肉に焦点を当てています。このプロトコルでは、ドライアイスを使用してマウス咬筋と前脛骨筋の凍結損傷を誘発し、口腔顔面筋線維症モデルを作成しました。筋衛星細胞と線維脂肪形成前駆細胞の時間的動態は、2つの筋肉間で異なり、筋線維再生の障害と過剰な細胞外マトリックス沈着につながった。このモデルの助けを借りて、口腔顔面領域の筋肉再生に関するより深い調査を実施し、口腔顔面疾患の患者に対する治療アプローチを開発できます。
Introduction
口腔顔面筋は、咀嚼、発話、呼吸、表情などの日常的な生理活動において重要です1。しかし、先天性口腔顔面奇形では、これらの筋肉は萎縮性および線維性の変化を示し、身体の健康と社会的認知の障害につながります2。顔面再建手術は依然として第一選択治療ですが、術後患者の最大30〜70%が依然として筋肉の喪失と筋肉機能障害に苦しんでいます3,4 口腔顔面筋の再生の失敗は、手術だけでは修正できない内因性要因に起因しています。
口腔顔面筋の出現は進化的な新規性であり、複雑な脊椎動物の頭部と心室5,6を伴います。体節由来の四肢とは異なり、口腔顔面筋は分枝弓7に由来します。これらの系統発生的および個体発生的な特徴は、彼らを明確な再生行動の素因となる可能性があります8。咬筋(MAS)は、前脛骨筋(TA)が同程度の損傷にさらされた後に完全に再生した時点で、重度の線維化を発症したことが報告されています1,9。しかし、再生の根本的なメカニズムは、まだ十分に理解されていません。
本研究では、口腔顔面筋の再生に関する検討を容易にするために、マウスの咬筋の凍結損傷モデルを確立した。線維症の表現型を評価するための時点として、損傷後14日を選択しました。これは、2つの筋肉間で識別可能な分岐が検出可能な最も早い時点であったためです。損傷後のMASの完全な再生には、少なくとも40週間が必要です1。一貫して、この研究では、損傷後14日でのTAの通常の再生と比較して、MASの凍結損傷後のコラーゲンの顕著な沈着が明らかになりました。このモデルの助けを借りて、筋萎縮と線維症のさらなる機構研究を行うことができ、その結果、手術後の口腔顔面筋の再生を促進するための潜在的な治療法の開発に役立ちます。
Protocol
この研究のすべての動物手順は、四川大学西中国口腔病学学校の倫理委員会(WCHSIRB-D-2020-114)によってレビューされ、承認されました。雄のC57BL/6マウス(5週齢)を、湿度制御(53±2%)および温度制御(23±2°C)の施設で飼育し、12時間の明暗サイクルで飼育しました。このプロトコールで使用されるすべての材料、試薬、および機器に関連する詳細については、 材料の表 を参照してくださ?…
Representative Results
HEとシリウスレッド染色(図4および補足図S1)により、この凍結損傷モデルでTAの完全な筋肉再生が明らかになりました。対照的に、MASは筋線維再生の障害と過剰な細胞外マトリックス沈着を示しました。無傷のMAS筋とTA筋の組織型を図4A、Bに示します。ここでは、筋線維が整列しており、線維化領域は間質性空?…
Discussion
骨格筋の再生を研究するためのさまざまな損傷モデルがあり、これには物理的、化学的、および外科的刺激の使用が含まれます10,11,12,13,14,15,16。カルジオトキシンと塩化バリウムは、筋肉の再生を開始するために最も?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
本研究は、四川省健康福祉委員会(助成番号:21PJ063)および中国国家自然科学基金会(助成番号:82001031)からの助成を受けて行われました。
Materials
| 1 mL syringe | Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China) | 1-ml syringe | / |
| Acetone | Chron Chemicals | Aceton | / |
| Adhesion microscope slides | Citotest Scientific | 188105 | / |
| Animal depilatory | Phygene Scientific | PH1877 | / |
| BSA (bovine serum albumin) | Solarbio Life Sciences | A8010 | / |
| DAPI | Solarbio Life Sciences | C0065 | / |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150129 | 1:200 |
| donkey serum | Solarbio Life Sciences | SL050 | / |
| Dry Ice | Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) | rice-shaped dry ice | / |
| IFKine Red Donkey anti-rabbit | Abbkine Scientific Company | A24421 | 1:200 |
| Insulation barrels (big) | Thermos | D600 | / |
| Insulation barrels (small) | Polar Ware | 250B | / |
| Isoflurane | RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China) | R510-22 | / |
| Isopentane | MACKLIN | M813375 | / |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | 1:1000 |
| Liquid nitrogen | Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) | / | / |
| M.O.M kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Mice | Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China) | 5 weeks old | / |
| mounting medium | Solarbio Life Sciences | S2100 | / |
| Nertral balsam | Solarbio Life Sciences | G8590 | / |
| Pax7 | Developmental Studies Hybridoma Bank | Pax7 | 1:5 |
| Pdgfra | R&D systems | AF1062 | 1:40 |
| Sirus Red Staining Kit | Solarbio Life Sciences | G1472 | / |
| Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture) | Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China) | / | / |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | / |
| Triton | Shanghai Scigrace Biotech | ABIO-Biofroxx-0006A | / |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 50 | / |
References
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Cite This Article
Cheng, X., Huang, Y., Li, Y., Li, J., Wang, Y. Freezing Injury in Mouse Masseter Muscle to Establish an Orofacial Muscle Fibrosis Model. J. Vis. Exp. (202), e65847, doi:10.3791/65847 (2023).