Замораживание травмы жевательной мышцы мыши для создания модели фиброза орофациальных мышц
Summary
Целью этого протокола является установление модели фиброза орофациальных мышц. Сравнение гистологии между жевательной мышцей мышей и передней большеберцовой мышцей после травмы обморожения подтвердило фиброз жевательной мышцы. Эта модель облегчит дальнейшее изучение механизма, лежащего в основе фиброза орофациальных мышц.
Abstract
Орофациальная мышца представляет собой подмножество скелетной мышечной ткани с четкой эволюционной траекторией и происхождением развития. В отличие от мышц конечностей, полученных из сомита, орофациальные мышцы берут начало от жаберных дуг, с исключительным вкладом черепного нервного гребня. Недавнее исследование показало, что регенерация также отличается в группе орофациальных мышц. Тем не менее, лежащий в основе механизм регулирования еще предстоит раскрыть. Современные модели регенерации скелетных мышц в основном сосредоточены на мышцах конечностей и туловища. В этом протоколе сухой лед использовался для индуцирования травмы замерзания жевательной мышцы мыши и передней большеберцовой мышцы для создания модели фиброза орофациальной мышцы. Временная динамика мышечных сателлитных клеток и фиброадипогенных предшественников различалась между двумя мышцами, что приводило к нарушению регенерации миоволокон и чрезмерному отложению внеклеточного матрикса. С помощью этой модели можно провести более глубокое исследование регенерации мышц в орофациальной области для разработки терапевтических подходов к пациентам с орофациальными заболеваниями.
Introduction
Орофациальные мышцы имеют решающее значение в повседневной физиологической деятельности, такой как жевание, речь, дыхание и мимика1. Однако при врожденных орофациальных деформациях эти мышцы демонстрируют атрофические и фиброзные изменения, что приводит к нарушению здоровья тела и социального познания2. Реконструктивная хирургия лица остается лечением первой линии, но до 30-70% послеоперационных пациентов по-прежнему страдают от потери мышечной массы и мышечной дисфункции 3,4 Неудача регенерации орофациальных мышц объясняется внутренними факторами, которые не могут быть исправлены только хирургическим путем.
Появление орофациальных мышц является эволюционным новшеством, сопровождающим сложную голову позвоночных и камерное сердце 5,6. В отличие от своих сомитных аналогов конечностей, орофациальные мышцы берут начало от жаберной дуги7. Эти филогенетические и онтогенетические признаки могут предрасполагать их к различным регенеративным моделямповедения. Сообщалось, что жевательная мышца (MAS) развила тяжелый фиброз в то время, когда передняя мышца большеберцовой кости (TA) полностью регенерировалась после воздействия той же степени травмы. Тем не менее, основной механизм регенерации остается плохо изученным.
В этом исследовании была создана модель травмы замораживания жевательной мышцы мышей, чтобы облегчить исследование регенерации орофациальных мышц. Мы выбрали 14 дней после травмы в качестве временной точки для оценки фенотипа фиброза, поскольку это была самая ранняя временная точка, когда было обнаружено заметное расхождение между двумя мышцами. Для полной регенерации МАС после травмы требуется не менее 40 недель1. Как и следовало ожидать, в этом исследовании было выявлено значительное отложение коллагена после замораживания МАС по сравнению с регулярной регенерацией ТА через 14 дней после травмы. С помощью этой модели можно проводить дальнейшие механистические исследования мышечной атрофии и фиброза, что, в свою очередь, поможет разработке потенциальных терапевтических путей для содействия регенерации орофациальных мышц после операции.
Protocol
Representative Results
Discussion
Существует множество моделей травм для изучения регенерации скелетных мышц, включая использование физических, химических и хирургических стимулов 10,11,12,13,14,15,16.</s…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Это исследование было поддержано грантами Комитета по здравоохранению и благополучию провинции Сычуань (номер гранта: 21PJ063) и Национального фонда естественных наук Китая (номер гранта: 82001031).
Materials
| 1 mL syringe | Shifeng Medical Apparatus and Instrument (Chengdu, Sichuan, China) | 1-ml syringe | / |
| Acetone | Chron Chemicals | Aceton | / |
| Adhesion microscope slides | Citotest Scientific | 188105 | / |
| Animal depilatory | Phygene Scientific | PH1877 | / |
| BSA (bovine serum albumin) | Solarbio Life Sciences | A8010 | / |
| DAPI | Solarbio Life Sciences | C0065 | / |
| Donkey anti-goat Alexa Fluor 488 | Abcam | ab150129 | 1:200 |
| donkey serum | Solarbio Life Sciences | SL050 | / |
| Dry Ice | Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) | rice-shaped dry ice | / |
| IFKine Red Donkey anti-rabbit | Abbkine Scientific Company | A24421 | 1:200 |
| Insulation barrels (big) | Thermos | D600 | / |
| Insulation barrels (small) | Polar Ware | 250B | / |
| Isoflurane | RWD Life Technology Company (Shenzhen, Guangdong, China) | R510-22 | / |
| Isopentane | MACKLIN | M813375 | / |
| Laminin | Sigma-Aldrich | L9393 | 1:1000 |
| Liquid nitrogen | Sinrro Technology (Chengdu, Sichuan, China) | / | / |
| M.O.M kit | Vector Laboratories | BMK-2202 | |
| Mice | Dashuo Biological Technology Company(Chengdu, Sichuan, China) | 5 weeks old | / |
| mounting medium | Solarbio Life Sciences | S2100 | / |
| Nertral balsam | Solarbio Life Sciences | G8590 | / |
| Pax7 | Developmental Studies Hybridoma Bank | Pax7 | 1:5 |
| Pdgfra | R&D systems | AF1062 | 1:40 |
| Sirus Red Staining Kit | Solarbio Life Sciences | G1472 | / |
| Surgical instruments (forceps, scissors, needle holder, scalpel, and suture) | Zhuoyue Medical Instrument (Suqian, Jiangsu, China) | / | / |
| Tissue-tek OCT | Sakura | 4583 | / |
| Triton | Shanghai Scigrace Biotech | ABIO-Biofroxx-0006A | / |
| Zoletil | Virbac | Zoletil 50 | / |
References
- Yoshioka, K., Kitajima, Y., Seko, D., Tsuchiya, Y., Ono, Y. The body region specificity in murine models of muscle regeneration and atrophy. Acta Physiologica. 231 (1), e13553 (2021).
- Worley, M. L., Patel, K. G., Kilpatrick, L. A. Cleft lip and palate. Clinics in Perinatology. 45 (4), 661-678 (2018).
- Pai, B. C. J., Hung, Y. -. T., Wang, R. S. H., Lo, L. -. J. Outcome of patients with complete unilateral cleft lip and palate: 20-year follow-up of a treatment protocol. Plastic and Reconstructive Surgery. 143 (2), 359e-367e (2019).
- Parsaei, Y., Chandler, L., Smetona, J. T., Lopez, J., Steinbacher, D. Aesthetic repair of unilateral cleft lip using the modified inferior triangle and adjunctive techniques. Plastic and Reconstructive Surgery. 149 (1), 70e-73e (2022).
- Schubert, F. R., Singh, A. J., Afoyalan, O., Kioussi, C., Dietrich, S. To roll the eyes and snap a bite – function, development and evolution of craniofacial muscles. Seminars In Cell & Developmental Biology. 91, 31-44 (2019).
- Vyas, B., Nandkishore, N., Sambasivan, R. Vertebrate cranial mesoderm: developmental trajectory and evolutionary origin. Cellular and Molecular Life Sciences: CMLS. 77 (10), 1933-1945 (2020).
- Sambasivan, R., Kuratani, S., Tajbakhsh, S. An eye on the head: the development and evolution of craniofacial muscles. Development. 138 (12), 2401-2415 (2011).
- Cheng, X., et al. Head muscle fibro-adipogenic progenitors account for the tilted regeneration towards fibrosis. Biochemical and Biophysical Research Communications. 589, 131-138 (2022).
- Pavlath, G. K., et al. Heterogeneity among muscle precursor cells in adult skeletal muscles with differing regenerative capacities. Developmental Dynamics. 212 (4), 495-508 (1998).
- Camacho-Alonso, F., et al. Regeneration of lingual musculature in rats using myoblasts over porcine bladder acellular matrix. Oral Diseases. 27 (6), 1580-1589 (2021).
- LeBoff, M. S., et al. The clinician’s guide to prevention and treatment of osteoporosis. Osteoporosis International. 33 (10), 2049-2102 (2022).
- Julien, A., et al. Direct contribution of skeletal muscle mesenchymal progenitors to bone repair. Nature Communications. 12 (1), 2860 (2021).
- Mahdy, M. A. A. Glycerol-induced injury as a new model of muscle regeneration. Cell and Tissue Research. 374 (2), 233-241 (2018).
- Guardiola, O., et al. Induction of acute skeletal muscle regeneration by cardiotoxin injection. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (119), 54515 (2017).
- Larouche, J. A., Wallace, E. C., Spence, B. D., Buras, E., Aguilar, C. A. Spatiotemporal mapping of immune and stem cell dysregulation after volumetric muscle loss. JCI Insight. 8 (7), e162835 (2023).
- Anderson, S. E., et al. Determination of a critical size threshold for volumetric muscle loss in the mouse quadriceps. Tissue Engineering. Part C, Methods. 25 (2), 59-70 (2019).
- Lukjanenko, L., et al. Aging disrupts muscle stem cell function by impairing matricellular WISP1 secretion from fibro-adipogenic progenitors. Cell Stem Cell. 24 (3), 433-446.e7 (2019).
- Dong, J., Dong, Y., Chen, Z., Mitch, W. E., Zhang, L. The pathway to muscle fibrosis depends on myostatin stimulating the differentiation of fibro/adipogenic progenitor cells in chronic kidney disease. Kidney International. 91 (1), 119-128 (2017).
- Lemos, D. R., et al. Nilotinib reduces muscle fibrosis in chronic muscle injury by promoting TNF-mediated apoptosis of fibro/adipogenic progenitors. Nature Medicine. 21 (7), 786-794 (2015).
- Joe, A. W. B., et al. Muscle injury activates resident fibro/adipogenic progenitors that facilitate myogenesis. Nature Cell Biology. 12 (2), 153-163 (2010).
- Biferali, B., Proietti, D., Mozzetta, C., Madaro, L. Fibro-adipogenic progenitors cross-talk in skeletal muscle: the social network. Frontiers In Physiology. 10, 1074 (2019).
