A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Wir beschreiben ein detailliertes Protokoll für die Präparation von post-kryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die subretinale Verabreichung dieser Zellen in rd10-Mäusen .

Abstract

Die Regeneration von Photorezeptorzellen mit humanen pluripotenten Stammzellen ist eine vielversprechende Therapie für die Behandlung von erblichen und alternden Netzhauterkrankungen in fortgeschrittenen Stadien. Wir haben gezeigt, dass die humane rekombinante retina-spezifische Laminin-Isoform-Matrix in der Lage ist, die Differenzierung von humanen embryonalen Stammzellen (hESCs) zu Photorezeptor-Vorläuferzellen zu unterstützen. Darüber hinaus hat die subretinale Injektion dieser Zellen auch eine teilweise Wiederherstellung in den rd10-Nagetier – und Kaninchenmodellen gezeigt. Es ist bekannt, dass die subretinale Injektion eine etablierte Methode ist, die verwendet wurde, um pharmazeutische Verbindungen zu den Photorezeptorzellen und der retinalen pigmentierten Epithelschicht (RPE) des Auges zu bringen, da sie sich in der Nähe des Zielraums befindet. Es wurde auch verwendet, um Adeno-assoziierte virale Vektoren in den subretinalen Raum zu bringen, um Netzhauterkrankungen zu behandeln. Die subretinale Verabreichung von pharmazeutischen Verbindungen und Zellen im Mausmodell ist aufgrund der begrenzten Größe des murinen Augapfels eine Herausforderung. Dieses Protokoll beschreibt das detaillierte Verfahren zur Vorbereitung von hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen für die Injektion und die subretinale Verabreichungstechnik dieser Zellen in genetischen Retinitis pigmentosa-Mutanten, rd10-Mäusen . Dieser Ansatz ermöglicht die Zelltherapie in den Zielbereich, insbesondere in die äußere Kernschicht der Netzhaut, wo Krankheiten auftreten, die zu einer Degeneration der Photorezeptoren führen.

Introduction

Erbliche Netzhauterkrankungen und altersbedingte Makuladegeneration führen zum Verlust von Photorezeptorzellen und schließlich zur Erblindung. Der retinale Photorezeptor ist die äußere Segmentschicht der Netzhaut, die aus spezialisierten Zellen besteht, die für die Phototransduktion (d. h. die Umwandlung von Licht in neuronale Signale) verantwortlich sind. Die Stäbchen- und Zapfen-Photorezeptorzellen grenzen an die retinale pigmentierte Schicht (RPE)¹. Die Photorezeptor-Zellersatztherapie zur Kompensation des Zellverlustes ist ein aufkommender und sich entwickelnder therapeutischer Ansatz. Embryonale Stammzellen (ESCs)^2,3,4, induzierte pluripotente Stammzellen (iPSCs) und retinale Vorläuferzellen (RPCs⁾4,5,6,7,8 wurden verwendet, um die geschädigten Photorezeptorzellen wiederherzustellen. Der subretinale Raum, ein begrenzter Raum zwischen der Netzhaut und dem RPE, ist aufgrund seiner Nähe ein attraktiver Ort, um diese Zellen abzulagern, um beschädigte Photorezeptorzellen, RPE und Mueller-Zellen zu ersetzen ^9,10,11.

Gen- und Zelltherapien haben in präklinischen Studien den subretinalen Raum für die regenerative Medizin bei verschiedenen Netzhauterkrankungen genutzt. Dies umfasst die Verabreichung von funktionellen Kopien des Gens oder von Gen-Editierungswerkzeugen in Form von entweder Anti-Sense-Oligonukleotid-Therapie^12,13 oder CRISPR/Cas9 oder Base-Editierung über eine auf Adeno-assoziierten Viren (AAV) basierende Strategie 14,15,16, Implantation von Materialien (z. B. RPE-Folie, Netzhautprothetik 17,18,19) und differenzierten aus Stammzellen gewonnenen Netzhaut-Organoiden ^20,21,22 zur Behandlung von Netzhaut- und RPE-bedingten Erkrankungen. Klinische Studien mit hESC-RPE³¹ im subretinalen Raum zur Behandlung der RPE65-assoziierten Leber-kongenitalen Amaurose (LCA)^23,24, der CNGA3-verknüpften Achromatopsie²⁵, der MERTK-assoziierten Retinitis pigmentosa²⁶ und der Choroiderämie 27,28,29,30 haben sich als wirksamer Ansatz erwiesen. Die direkte Injektion von Zellen in die Nähe des geschädigten Bereichs verbessert die Wahrscheinlichkeit einer Zellansiedlung in der entsprechenden Region, der synaptischen Integration und schließlich einer visuellen Verbesserung erheblich.

Obwohl die subretinale Injektion in menschlichen und großäugigen Modellen (d. h. Schwein 32,33,34,35, Kaninchen 36,37,38,39,40 und nicht-menschliche Primaten 41,42,43) etabliert wurde, ist eine solche Injektion im Mausmodell aufgrund der eingeschränkten Größe des Augapfels und enormer Linse, die das Mausauge einnimmt 44,45,46. Genetisch veränderte Modelle sind jedoch nur bei Kleintieren und nicht bei Großtieren (d.h. Kaninchen und nicht-menschlichen Primaten) verfügbar, daher lenkt die subretinale Injektion in Mäuse die Aufmerksamkeit auf die Erforschung neuer therapeutischer Ansätze bei retinalen genetischen Erkrankungen. Drei Hauptansätze werden verwendet, um Zellen oder AAVs in den subretinalen Raum zu bringen, nämlich die transkorneale Route, die transsklerale Route und die Pars-plana-Route (siehe Abbildung 2). Transkorneale und transsklerale Wege sind mit Kataraktbildung, Synechien, Aderhautblutungen und Reflux von der Injektionsstelle assoziiert 11,44,45,47,48,49. Wir haben den Pars-Plana-Ansatz als direkte Visualisierung des Injektionsprozesses gewählt, und die Injektionsstelle kann in Echtzeit unter dem Mikroskop erreicht werden.

Wir haben kürzlich eine Methode beschrieben, mit der humane embryonale Stammzellen (hES-Zellen) unter xenofreien, chemisch definierten Bedingungen unter Verwendung der rekombinanten humanen Retina-spezifischen Laminin-Isoform LN523 in Photorezeptor-Vorläuferzellen differenziert werden können. Da LN523 in der Netzhaut gefunden wurde, stellten wir die Hypothese auf, dass die extrazelluläre Matrixnische der menschlichen Netzhaut in vitro rekapituliert werden könnte und dadurch die Photorezeptordifferenzierung von den hES-Zellen unterstützt^{werden könnte 36}. Die einzellige Transkriptomanalyse zeigte, dass nach 32 Tagen Photorezeptor-Vorläuferzellen erzeugt wurden, die Zapfenstäbchen-Homöobox und Recoverin coexprimieren. Ein retinal degeneration 10 (rd10) mutiertes Mausmodell, das die autosomale humane Retinitis pigmentosa nachahmt, wurde verwendet, um die Wirksamkeit der day 32 hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen in-vivo zu untersuchen. Die hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen wurden in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen bei P20 injiziert, wo Photozeptor-Dysfunktion und -Degeneration andauern³⁶. Hier beschreiben wir ein detailliertes Protokoll für die Herstellung der postkryokonservierten hESC-abgeleiteten Photorezeptor-Vorläuferzellen und die Abgabe in den subretinalen Raum von rd10-Mäusen . Diese Methode kann auch verwendet werden, um AAVs, Zellsuspensionen, Peptide oder Chemikalien in den subretinalen Raum von Mäusen zu verabreichen.

Protocol

Die In-vivo-Experimente wurden in Übereinstimmung mit den Richtlinien und Protokollen durchgeführt, die vom Institutional Animal Care and Use Committee of SingHealth (IACUC) und der Erklärung der Association for Research in Vision and Ophthalmology (ARVO) für die Verwendung von Tieren in der Augen- und Sehforschung genehmigt wurden. Die Welpen wurden von P17 (vor der Transplantation) auf P30 (nach der Transplantation) immunsupprimiert, indem sie mit Ciclosporin (260 g/L) gefüttert wurden. <p class="jove…

Representative Results

Die 10-μl-Glasspritze wurde gemäß den Anweisungen des Herstellers zusammengebaut (Abbildung 1), und die stumpfe Nadel, die zur Abgabe der Zellsuspension/des Mediums verwendet wird, ist in Abbildung 1B dargestellt. Verschiedene Ansätze für die subretinale Injektion sind in Abbildung 2 dargestellt. In diesem Protokoll beschreiben wir den Pars-Plana-Ansatz (Abbildung 2C). Die stumpfe Nadel, die auf ei…

Discussion

Die subretinale Injektion wurde für die Zellsuspensionstransplantation zur Behandlung von RPE und Netzhauterkrankungen verwendet 23,25,26,27,28,31,40. Dieser Ansatz ist in Studien an Nagetieren nicht nur für Zelltransplantations- und Gentherapieansätze, sondern auch für die Evaluierung n…

Materials

0.3% Tobramycin	Novartis	NDC  0078-0813-01	Tobrex (3.5 g)
0.3% Tobramycin and 0.1% Dexamethasone	Novartis	NDC 0078-0876-01	Tobradex (3.5 g)
0.5% Proparacaine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0016-15	0.5% Alcaine (15 mL)
1 mL Tuberculin syringe	Turemo	SS01T2713
1% Tropicamide	Alcon	NDC 0998-0355-15	1% Mydriacyl (15 mL)
2.5% Phenylephrine hydrochloride	Alcon	NDC 0998-0342-05	2.5% Mydfrin (5 mL)
24-well tissue culture plate	Costar	3526
30 G Disposable needle	Becton Dickinson (BD)	305128
33 G, 20 mm length blunt needles	Hamilton	7803-05
Automated Cell Counter	NanoEnTek	Model: Eve
B27 without Vitamin A	Life Technologies	12587001	2%36
Buprenorphine	Ceva		Vetergesic vet (0.3 mg/mL)
CKI-7	Sigma	C0742	5 µM36
Cyclosporine	Novartis		260 g/L in drinking water
Day 32 hESC-derived photoreceptor progenitor cells	DUKE-NUS Medical School		Human embryonic stem cells are differentiated for 32 days. See protocol in Ref 36.
Gauze	Winner Industries Co. Ltd.	1SNW475-4
Glasgow Minimum Essential Medium	Gibco	11710–035
hESC cell line H1	WiCell Research Institute	WA01
Human brain-derived neurotrophic factor (BDNF)	Peprotech	450-02-50	10 ng/mL36
Human ciliary neurotrophic factor (CNTF)	Prospec-Tany Technogene	CYT-272	10 ng/mL36
Ketamine hydrochloride (100 mg/mL)	Ceva Santé Animale	KETALAB03
LN-521	Biolamina	LN521-02	1 µg36
mFreSR	STEMCELL Technologies	5854
Microlitre glass syringe (10 mL)	Hamilton	7653-01
N-[N-(3,5-difluorophenacetyl-L-alanyl)]-S-phenylglycine t-butyl ester (DAPT)	Selleckchem	S2215	10 µM36
N-2 supplement	Life Technologies	A13707-01	1%36
Non-essential amino acids (NEAA)	Gibco	11140–050	1x36
NutriStem XF Media	Satorius	05-100-1A
Operating microscope	Zeiss	OPMI LUMERA 700	With Built-in iOCT function
PRDM (Photoreceptor differentiation medium, 50ml)	DUKE-NUS Medical School		See media composition36. Basal Medium, 10 µM DAPT, 10 ng/mL BDNF, 10 ng/mL CNTF, 0.5 µM Retinoic acid, 2% B27 and 1% N2. Basal Medium: 1x GMEM, 1 mM sodium pyruvate, 0.1 mM B-mercaptoethanol, 1x Non-essential amino acids (NEAA).
Pyruvate	Gibco	11360–070	1 mM36
Rd10 mice	Jackson Laboratory	B6.CXB1-Pde6brd10/J mice	Gender: male/female, Age: P20 (injection), Weight: 3-6 g
Retinoic acid	Tocris Bioscience	0695/50	0.5 µM36
Round Cover Slip (12 mm)	Fisher Scientific	12-545-80
SB431542	Sigma	S4317	0.5 µM36
Vidisic Gel (10 g)	Dr. Gerhard Mann
Xylazine hydrochloride (20 mg/mL)	Troy Laboratories	LI0605
β-mercaptoethanol	Life Technologies	21985–023	0.1 mM36