Multiplex-Immunhistochemie-Färbung für paraffineingebettetes Lungenkrebsgewebe
Summary
Dieses experimentelle Protokoll beschreibt und optimiert eine Multiplex-Immunhistochemie (IHC)-Färbemethode, hauptsächlich durch die Optimierung der Inkubationsbedingungen von Einzelkanal-Antikörpern und die Anpassung der Einstellungen von Antikörpern und Kanälen, um die Probleme der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels in Lungenkrebsgeweben klinischen Ursprungs zu lösen.
Abstract
Lungenkrebs ist weltweit die Hauptursache für bösartige tumorbedingte Morbidität und Mortalität, und die komplexe Tumormikroumgebung gilt als die häufigste Todesursache bei Lungenkrebspatienten. Die Komplexität der Tumormikroumgebung erfordert effektive Methoden, um Zell-Zell-Beziehungen in Tumorgeweben zu verstehen. Die Multiplex-Immunhistochemie (mIHC)-Technik ist zu einem Schlüsselwerkzeug geworden, um die Beziehung zwischen der Expression von Proteinen vor und hinter Signalwegen in Tumorgeweben abzuleiten und klinische Diagnosen und Behandlungspläne zu entwickeln. mIHC ist eine Multi-Label-Immunfluoreszenz-Färbemethode, die auf der Tyramine Signal Amplification (TSA)-Technologie basiert und mehrere Zielmoleküle gleichzeitig auf derselben Gewebeschnittprobe nachweisen kann, um unterschiedliche Protein-Co-Expressions- und Co-Lokalisierungsanalysen zu erreichen. In diesem experimentellen Protokoll wurden paraffineingebettete Gewebeschnitte von Lungenplattenepithelkarzinomen klinischen Ursprungs einer immunhistochemischen Multiplex-Färbung unterzogen. Durch die Optimierung des experimentellen Protokolls wurde eine immunhistochemische Multiplex-Färbung von markierten Zielzellen und Proteinen erreicht, wodurch das Problem der Autofluoreszenz und des Kanalwechsels im Lungengewebe gelöst wurde. Darüber hinaus wird die immunhistochemische Multiplex-Färbung häufig bei der experimentellen Validierung von tumorbezogenen Hochdurchsatzsequenzierungen, einschließlich Einzelzellsequenzierung, Proteomik und Geweberaumsequenzierung, eingesetzt und liefert intuitive und visuelle Validierungsergebnisse für die Pathologie.
Introduction
Die mehr als 20-jährige Tyramin-Signalamplifikation (TSA) ist eine Klasse von Assay-Techniken, die Meerrettichperoxidase (HRP) für die In-situ-Markierung von Zielantigenen mit hoher Dichte verwenden und in enzymgebundenen Immunosorbent-Assays (ELISAs), In-situ-Hybridisierung (ISH), Immunhistochemie (IHC) und anderen Techniken zum Nachweis biologischer Antigene weit verbreitet sind. Erhebliche Verbesserung der Empfindlichkeit des detektierten Signals1. Die polychromatische Opalfärbung auf Basis der TSA-Technologie wurde kürzlich entwickelt und in mehreren Studien weit verbreitet 2,3,4,5. Die traditionelle Immunfluoreszenzfärbung (IF) bietet Forschern ein einfaches Werkzeug zum Nachweis und Vergleich der Verteilung von Proteinen in den Zellen und Geweben verschiedener Modellorganismen. Es basiert auf einer Antikörper-/Antigen-spezifischen Bindung und umfasst direkte und indirekte Ansätze6. Bei der direkten Immunfärbung wird ein Fluorophor-konjugierter Primärantikörper gegen das interessierende Antigen verwendet, was eine direkte Fluoreszenzdetektion mit einem Fluoreszenzmikroskop ermöglicht. Der indirekte Immunfärbeansatz beinhaltet die Anwendung eines Fluorophor-konjugierten Sekundärantikörpers gegen den nicht konjugierten Primärantikörper 6,7.
Herkömmliche Immunfluoreszenz-Färbemethoden können nur ein, zwei oder in einigen Fällen drei Antigene in Geweben färben, was eine große Einschränkung bei der Gewinnung der reichhaltigen Informationen in Gewebeschnitten darstellt. Die Interpretation quantitativer Ergebnisse hängt oft von visueller Beobachtung und genauer Quantifizierung durch Bildgebungssoftware wie ImageJ ab. Es gibt technische Einschränkungen, wie z. B. die Einschränkung der Antikörperspezies, schwache fluoreszierende Markierungssignale und die Farbüberlappung von Fluoreszenzfarbstoffen (Tabelle 1). Die Opal-Multiplex-IHC-Technik (mIHC) basiert auf der TSA-Ableitung, die die Multiplex-Färbung und differentielle Markierung von mehr als 7-9 Antigenen auf demselben Gewebeschnitt ohne Einschränkung der Herkunft des Primärantikörpers ermöglicht, aber eine hohe Spezifität des entsprechenden Antikörpers gegen das Antigen erfordert. Das Färbeverfahren ähnelt dem der normalen Immunfluoreszenzfärbung, mit zwei Unterschieden: Bei jeder Färberunde wird nur ein Antikörper verwendet und ein Antikörper-Elutionsschritt hinzugefügt. Antikörper, die durch nichtkovalente Bindungen an das Antigen gebunden sind, können durch Mikrowellenelution entfernt werden, aber das TSA-Fluoreszenzsignal, das durch kovalente Bindungen an die Oberfläche des Antigens gebunden ist, bleibt erhalten.
Aktivierte Tyramin (T)-Moleküle, die mit dem Farbstoff markiert sind, sind am Zielantigen stark angereichert, was eine effiziente Verstärkung des Fluoreszenzsignals ermöglicht. Dies ermöglicht die direkte Markierung des Antigens ohne Antikörperinterferenz, und dann kann nach mehreren Färbezyklen eine mehrfarbige Markierung erreicht werden 8,9,10 (Abbildung 1). Obwohl diese Technologie zuverlässige und genaue Bilder für die Untersuchung von Krankheiten liefert, kann die Erstellung einer nützlichen Multiplex-Fluoreszenz-Immunhistochemie (mfIHC)-Färbestrategie aufgrund der Notwendigkeit umfangreicher Optimierungen und Designs zeitaufwändig und anspruchsvoll sein. Daher wurde dieses Multiplex-Panel-Protokoll in einem automatisierten IHC-Färbegerät mit einer kürzeren Färbezeit als das manuelle Protokoll optimiert. Dieser Ansatz kann von jedem Forscher für immunonkologische Studien an humanen formalinfixierten und paraffineingebetteten (FFPE) Gewebeproben direkt angewendet und angepasst werden11. Darüber hinaus werden die Methoden zur Objektträgervorbereitung, Antikörperoptimierung und Multiplex-Design hilfreich sein, um robuste Bilder zu erhalten, die genaue zelluläre Interaktionen in situ darstellen, und um die Optimierungszeit für die manuelle Analyse zu verkürzen12.
Das mfIHC umfasst hauptsächlich die Bilderfassung und Datenanalyse. In Bezug auf die Bildaufnahme müssen mehrfarbig markierte, komplex gefärbte Proben mit professionellen spektralen Bildgebungsgeräten detektiert werden, um die verschiedenen gemischten Farbsignale zu identifizieren und Bilder mit hohem Signal-Rausch-Verhältnis ohne Störungen durch Gewebeautofluoreszenz zu erhalten. Zu den aktuellen Geräten für die spektrale Bildgebung gehören hauptsächlich spektrale konfokale Mikroskope und multispektrale Gewebebildgebungssysteme. Das multispektrale Gewebebildgebungssystem ist ein professionelles Bildgebungssystem, das für die quantitative Analyse von Gewebeschnitten entwickelt wurde, und sein wichtigstes Merkmal ist die Erfassung von Bildspektralinformationen, die sowohl morphologische Struktur- als auch optische Kartierungsinformationen biologischer Gewebeproben liefern13,14. Jedes Pixel im Spektralbild enthält eine vollständige Spektralkurve, und jeder Farbstoff (einschließlich Autofluoreszenz) hat sein entsprechendes charakteristisches Spektrum, das die vollständige Aufzeichnung und genaue Identifizierung von gemischten und überlappenden Multilabel-Signalen ermöglicht.
In Bezug auf die Datenanalyse sind mehrfarbig markierte Proben aufgrund der morphologischen Struktur und der Bestandteile der Gewebeproben äußerst komplex. Gewöhnliche Software kann verschiedene Gewebetypen nicht automatisch identifizieren. Daher wird eine intelligente quantitative Gewebeanalysesoftware für die quantitative Analyse der Antigenexpression in bestimmten Regionen verwendet 15,16,17,18.
Vor allem hat die Multilabel-Immunfluoreszenzfärbung in Kombination mit multispektraler Bildgebung und quantitativer Pathologie-Analysetechnologie die Vorteile einer großen Anzahl von Nachweiszielen, einer effektiven Färbung und einer genauen Analyse und kann daher die Genauigkeit der histomorphologischen Analyse erheblich verbessern, die räumliche Beziehung zwischen Proteinen mit zellulärer Auflösung aufdecken und dazu beitragen, reichhaltigere und zuverlässigere Informationen aus Gewebeschnittproben zu gewinnen19 (Tabelle 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
mIHC ist eine unverzichtbare experimentelle Technik im Bereich der wissenschaftlichen Forschung für die quantitative und räumliche Analyse mehrerer Proteinmarker auf Einzelzellebene in einem einzigen Gewebeschnitt, die intuitive und genaue Daten für die Untersuchung der Krankheitspathologie liefert, indem sie sich auf die detaillierte Gewebestruktur und die zellulären Interaktionen im Kontext des ursprünglichen Gewebes konzentriert. Die weit verbreitete Einführung der mIHC-Technologie erfordert optimierte und effek…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Die Autoren möchten den Mitgliedern des Clinical Pathology Research Institute West China Hospital danken, die technische Leitlinien für eine qualitativ hochwertige Multiplex-Immunfluoreszenz und IHC-Verarbeitung beigesteuert haben. Dieses Protokoll wurde von der National Natural Science Foundation of China (82200078) unterstützt.
Materials
| Reagents | |||
| Anti-CD8 | Abcam | ab237709 | Primary antibody, 1/100, PH9 |
| Anti-CD68 | Abcam | ab955 | Primary antibody, 1/300, PH9 |
| Anti-CK5/6 | Millipore | MAB1620 | Primary antibody, 1/150, PH9 |
| Anti-HMGCS1 | GeneTex | GTX112346 | Primary antibody, 1/300, PH6 |
| Animal nonimmune serum | MXB Biotechnologies | SP KIT-B3 | Antigen blocking |
| Fluormount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | Anti-fluorescent burst |
| Opal PolarisTM 7-Color Manual IHC Kit | Akoya | NEL861001KT | Opal mIHC Staining |
| Wash Buffer | Dako | K8000/K8002/K8007/K8023 | Washing the tissues slides |
| Software | |||
| HALO | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| inForm | intelligent quantitative tissue analysis software, paid software | ||
| PerkinElmer Vectra | multispectral tissue imaging systems, fully automatic scanning of tissue slides. | ||
| QuPath 0.3.2 | intelligent quantitative tissue analysis software, open source software, used in this experiment. |
References
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