Transient Middle Cerebral Artery okklusjon Modell av hjerneslag
Summary
Denne protokollen beskriver modellen for forbigående fokal cerebral iskemi hos mus gjennom intraluminal okklusjon av den midtre cerebrale arterien. I tillegg vises eksempler på utfallsvurdering ved hjelp av magnetisk resonansavbildning og atferdstester.
Abstract
Hjerneslag står som en viktig årsak til død eller kronisk funksjonshemming globalt. Likevel er eksisterende optimale behandlinger begrenset til reperfusjonsbehandlinger i den akutte fasen av iskemisk hjerneslag. For å få innsikt i slagfysiopatologi og utvikle innovative terapeutiske tilnærminger, spiller in vivo gnagermodeller av hjerneslag en grunnleggende rolle. Tilgjengeligheten av genmodifiserte dyr har spesielt drevet bruken av mus som eksperimentelle slagmodeller.
Hos slagpasienter er okklusjon av arteria cerebri media (MCA) en vanlig foreteelse. Følgelig involverer den mest utbredte eksperimentelle modellen intraluminal okklusjon av MCA, en minimalt invasiv teknikk som ikke krever kraniektomi. Denne prosedyren innebærer å sette inn et monofilament gjennom den eksterne halspulsåren (ECA) og fremme den gjennom den indre halspulsåren (ICA) til den når forgreningspunktet til MCA. Etter en arteriell okklusjon på 45 minutter fjernes monofilamentet for å tillate reperfusjon. Gjennom hele prosessen overvåkes cerebral blodstrøm for å bekrefte reduksjonen under okklusjon og påfølgende utvinning ved reperfusjon. Nevrologiske og vevsutfall evalueres ved hjelp av atferdstester og magnetisk resonans imaging (MRI) studier.
Introduction
Hjerneslag er en ødeleggende sykdom som rammer omtrent 15 millioner mennesker over hele verden årlig, ifølge WHO. Rundt en tredjedel av pasientene bukker under for tilstanden, mens en annen tredjedel opplever permanent funksjonshemming. Hjerneslag er en kompleks patologi som involverer ulike celletyper, for eksempel nevrale og perifere immunceller, vaskulatur og systemiske responser1. Det intrikate nettverket av reaksjoner utløst av slag på systemnivå kan for tiden ikke replikeres ved hjelp av in vitro-modeller . Derfor er eksperimentelle dyremodeller avgjørende for å dykke inn i sykdommens mekanismer og for å utvikle og teste nye terapier. Tidlig vevsreperfusjon er i dag eneste godkjente tiltak, enten ved trombolyse med vevstype plasminogenaktivator (tPA) eller endovaskulær trombektomi1.
Okklusjoner av den midtre cerebrale arterien (MCA) er hyppige hos slagpasienter. Følgelig ble gnagermodeller av forbigående MCA-okklusjon (tMCAo) opprinnelig utviklet hos rotter 2,3,4. I dag er genmodifiserte mus de mest brukte dyrene i eksperimentelle slagmodeller. I denne studien beskriver vi en minimalt invasiv modell av intraluminal tMCAo hos mus. Tilnærmingen utføres via halspulsåren i nakkenivå, uten kraniektomi.
Varigheten av okklusjonsperioden er en kritisk faktor som bestemmer omfanget av den iskemiske lesjonen. Selv korte okklusjoner på 10 minutter kan forårsake selektiv nevrondød uten et tilsynelatende infarkt, mens lengre okklusjoner, som vanligvis varer 30 til 60 minutter, resulterer i en viss grad av hjerneinfarkt. I motsetning til de proksimale og distale grenene av MCA som forsyner cortex og har sikkerheter, mangler lenticulo-striatale arterier som gir blod til striatum collaterals5. Som en konsekvens er det en større reduksjon av blodstrømmen i striatum enn i cortex etter tMCAo. Dermed påvirker okklusjoner på 30 minutter eller mindre generelt striatum, men ikke cortex, mens lengre okklusjoner, fra 45 minutter og utover, ofte genererer en iskemisk lesjon i hele MCA-territoriet, inkludert striatum og dorsolateral cortex.
For å sikre musens velvære, administrerer vi smertestillende midler før prosedyren og bruker anestesi under operasjonen. Likevel kan anestesi potensielt introdusere kunstige endringer i musens fysiologi og påvirke noen utfallsmål6. Det kirurgiske inngrepet, når det utføres av erfarent personell, varer vanligvis ca. 15 minutter for å indusere MCAo. Deretter avhenger den totale tiden under anestesi av okklusjonsperioden. For eksperimenter der minimering av anestesi er avgjørende, innebærer et alternativt trinn i prosedyren å avbryte anestesi i okklusjonsperioden og begrense den bare til de kirurgiske trinnene for å sette inn og trekke ut filamentet som okkluderer MCA. Denne tilnærmingen reduserer varigheten av anestesi og minimerer potensielle artifakteffekter på den eksperimentelle modellen 7,8. Derfor presenteres metoden for å indusere forbigående fokal iskemi ved intraluminal okklusjon av MCA med to varianter: med musen bedøvet i hele okklusjonsperioden eller med musen våken i denne perioden. I begge tilfeller bør en sham kirurgi utføres parallelt med inngrepet utført på iskemiske mus. I tillegg er data om utfallsvurdering gitt som målt ved atferdstester og MR på ulike tidspunkter etter reperfusjon. Til slutt diskuteres de viktigste faktorene som skal vurderes når man implementerer eksperimentell prosedyre.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den intraluminale tMCAo-prosedyren er den mest brukte modellen for fokal hjerneiskemi med reperfusjon i grunnforskning. For tiden er mus den foretrukne dyremodellen på grunn av tilgjengeligheten av genetisk modifiserte stammer. Det er imidlertid viktig å erkjenne at genetisk modifiserte mus og deres genetiske bakgrunn kan påvirke hjernens vaskularisering. Tilstedeværelsen av sikkerhetssirkulasjon og anastomoser mellom ulike arterielle territorier kan signifikant påvirke resultatene av eksperimentelle prosedyrer<sup …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Studie støttet av stipend PID2020-113202RB-I00 finansiert av Ministerio de Ciencia e Innovación (MCIN)/Agencia Estatal de Investigación (AEI), Gobierno de España/10.13039/501100011033 og “European Regional Development Fund (ERDF). En måte å skape Europa på». NCC og MAR hadde predoktorstipend (henholdsvis PRE2021-099481 og PRE2018-085737) finansiert av MCIN/AEI/ 10.13039/501100011033 og av “European Social Fund (ESF) Investing in your future”. Vi takker Francisca Ruiz-Jaén og Leonardo Márquez-Kisinousky for teknisk støtte. Vi anerkjenner støtten fra MR-bildeanlegget til Institut d’Investigacions Biomèdiques August Pi i Sunyer (IDIBAPS). Centres de Recerca de Catalunya (CERCA) Program of Generalitat de Catalunya støtter IDIBAPS.
Materials
| 6/0 suture | Arago | Vascular ligatures | |
| 6/0 suture with curved needle | Arago | Skin sutures | |
| 9 mg/mL Saline | Fresenius Kabi | CN616003 EC | For hydration |
| Anaesthesia system | SurgiVet | ||
| Blunt retractors, 1 mm wide | Fine Science Tools | 18200-09 | |
| Buprenorfine | Buprex | For pain relief | |
| Clamp applying forceps | Fine Science Tools | S&T CAF4 | |
| Dumont mini forceps | Fine Science Tools | M3S 11200-10 | |
| Forceps | Fine Science Tools | 91106-12 | |
| Glue | Loctite | To stick LDF probe to the skull | |
| Grip Strength Meter | IITC Life Science Inc. | #2200 | |
| Isoflurane | B-Braun | CN571105.8 | |
| LDF Perimed | Perimed | Periflux System 5000 | |
| LDF Probe Holders | Perimed | PH 07-4 | |
| Medical tape | |||
| MRI magnet | Bruker BioSpin, Ettlingen, Germany | BioSpec 70/30 horizontal animal scanner | |
| Needle Holder with Suture Cutter | Fine Science Tools | 12002-14 | |
| Nylon filament | Doccol | 701912PK5Re | |
| Recovery cage with heating pad | |||
| Sirgical scissors | Fine Science Tools | 91401-12 | |
| Small vessel cauterizer kit | Fine Science Tools | 18000-00 | |
| Stereomicroscope and cold light | Leica | M60 | |
| Suture tying forceps | Fine Science Tools | 18025-10 | |
| Thermostat, rectal probe and mouse pad | Letica Science Instruments | LE 13206 | |
| Vannas spring scissors (4mm cutting edge) | Fine Science Tools | 15019-10 | |
| Vascular clamps | Fine Science Tools | 00396-01 |
References
- Siddiqi, A. Z., Wadhwa, A. Treatment of acute stroke: current practices and future horizons. Cardiovascular Revascularization Medicine. 49, 56-65 (2023).
- Tamura, A., Graham, D. I., McCulloch, J., Teasdale, G. M. Focal cerebral ischemia in the rat: 1. Description of technique and early neuropathological consequences following middle cerebral artery occlusion. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 1, 53-60 (1981).
- Koizumi, J., Nakazawa, T., Ooneda, G. Experimental studies of ischemic brain edema. A new experimental model of cerebral embolism in rats in which recirculation can be introduced in the ischemic area. Japanese Journal of Stroke. 8, 1-8 (1986).
- Longa, E. Z., Weinstein, P. R., Carlson, R., Cummins, R. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats. Stroke. 20 (1), 84-91 (1989).
- Hossmann, K. A. Cerebral ischemia: Models, methods, and outcomes. Neuropharmacology. 55, 257-270 (2008).
- Seto, A., et al. Induction of ischemic stroke in awake freely moving mice reveals that isoflurane anesthesia can mask the benefits of a neuroprotection therapy. Frontiers in Neuroenergetics. 6, 1 (2014).
- Díaz-Marugan, L., et al. Poststroke lung infection by opportunistic commensal bacteria is not mediated by their expansion in the gut microbiota. Stroke. 54 (7), 1875-1887 (2023).
- Xie, L., Kang, H., Nedergaard, M. A novel model of transient occlusion of the middle cerebral artery in awake mice. Journal of Natural Sciences. 2 (2), e176 (2016).
- Arbaizar-Rovirosa, M., et al. Aged lipid-laden microglia display impaired responses to stroke. EMBO Molecular Medicine. 15 (2), e17175 (2023).
- Orsini, F., et al. Targeting mannose-binding lectin confers long-lasting protection with a surprisingly wide therapeutic window in cerebral ischemia. Circulation. 126 (12), 1484-1494 (2012).
- Majid, A., et al. Differences in vulnerability to permanent focal cerebral ischemia among 3 common mouse strains. Stroke. 31, 2707-2714 (2000).
- Rogers, D. C., Campbell, C. A., Stretton, J. L., Mackay, K. B. Correlation between motor impairment and infarct volume after permanent and transient middle cerebral artery occlusion in the rat. Stroke. 28, 2060-2065 (1997).
- Hedna, V. S., et al. Validity of Laser Doppler flowmetry in predicting outcome in murine intraluminal middle cerebral artery occlusion stroke. Journal of Vascular and Interventional Neurology. 8 (3), 74-82 (2015).
- Yin, L., et al. Laser speckle contrast imaging for blood flow monitoring in predicting outcomes after cerebral ischemia-reperfusion injury in mice. BMC Neuroscience. 23, 80 (2022).
- Thakkar, P. C., et al. Therapeutic relevance of elevated blood pressure after ischemic stroke in the hypertensive rats. Hypertension. 75 (3), 740-747 (2020).
- Yu, X., Feng, Y., Liu, R., Chen, Q. Hypothermia protects mice against ischemic stroke by modulating macrophage polarization through upregulation of interferon regulatory factor-4. Journal of Inflammation Research. 14, 1271-1281 (2021).
- Denorme, F., Portier, I., Kosaka, Y., Campbell, R. A. Hyperglycemia exacerbates ischemic stroke outcome independent of platelet glucose uptake. Journal of Thrombosis and Haemostasis. 19, 536-546 (2021).
