הקמת מודל פיזיולוגי למיקרו-גידולים וסקולריים אנושיים לחקר הסרטן
Summary
פרוטוקול זה מציג מודל גידול-על-שבב רלוונטי מבחינה פיזיולוגית לביצוע מחקר סרטן אנושי בסיסי ותרגומי בתפוקה גבוהה, קידום בדיקות סקר לתרופות, מידול מחלות וגישות רפואה מותאמת אישית עם תיאור של נהלי העמסה, תחזוקה והערכה.
Abstract
היעדר מודלים מתוקפים של סרטן המשחזרים את המיקרו-סביבה של הגידול של סרטן מוצק במבחנה נותר צוואר בקבוק משמעותי במחקר סרטן פרה-קליני ופיתוח טיפולי. כדי להתגבר על בעיה זו, פיתחנו את המיקרו-גידול הווסקולרי (VMT), או שבב הגידול, מערכת מיקרופיזיולוגית המדמה באופן מציאותי את המיקרו-סביבה האנושית המורכבת. ה-VMT יוצר דה נובו בתוך פלטפורמה מיקרופלואידית על ידי תרבית משותפת של מספר סוגי תאים אנושיים בתנאי זרימה פיזיולוגיים דינמיים. מבנה מיקרו-גידול מהונדס רקמות זה משלב רשת כלי דם מחוררת חיה התומכת במסת הגידול הגדלה, בדיוק כפי שכלי דם חדשים נוצרים עושים in vivo. חשוב לציין, תרופות ותאי מערכת החיסון חייבים לחצות את שכבת האנדותל כדי להגיע לגידול, תוך הדגמת מחסומים פיזיולוגיים in vivo למתן טיפול ויעילות. מכיוון שפלטפורמת VMT שקופה אופטית, ניתן להשיג הדמיה ברזולוציה גבוהה של תהליכים דינמיים כגון אקסטרווזיה של תאי מערכת החיסון וגרורות באמצעות הדמיה ישירה של תאים המסומנים באופן פלואורסצנטי בתוך הרקמה. יתר על כן, VMT שומר על הטרוגניות הגידול in vivo , חתימות ביטוי גנים ותגובות לתרופות. כמעט כל סוג גידול יכול להיות מותאם לפלטפורמה, ותאים ראשוניים מרקמות ניתוח טריות גדלים ומגיבים לטיפול תרופתי ב- VMT, מה שסולל את הדרך לרפואה מותאמת אישית באמת. כאן מתוארות השיטות להקמת ה-VMT ולניצולו למחקר אונקולוגי. גישה חדשנית זו פותחת אפשרויות חדשות לחקר גידולים ותגובות לתרופות, ומספקת לחוקרים כלי רב עוצמה לקידום חקר הסרטן.
Introduction
סרטן נותר דאגה בריאותית מרכזית ברחבי העולם והוא סיבת המוות השנייה בשכיחותה בארצות הברית. עבור שנת 2023 לבדה, המרכז הלאומי לסטטיסטיקה בריאותית צופה יותר מ -1.9 מיליון מקרי סרטן חדשים ומעל 600,000 מקרי מוות מסרטן המתרחשים בארה”ב1, מה שמדגיש את הצורך הדחוף בגישות טיפול יעילות. עם זאת, כיום, רק 5.1% מהתרופות האנטי-סרטניות שנכנסות לניסויים קליניים זוכות בסופו של דבר לאישור ה-FDA. כישלון של מועמדים מבטיחים להתקדם בהצלחה בניסויים קליניים ניתן לייחס באופן חלקי לשימוש במערכות מודל לא פיזיולוגיות, כגון תרביות דו-ממדיות וכדוריות, במהלך פיתוח תרופות פרה-קליניות2. מודלים קלאסיים אלה של סרטן חסרים מרכיבים חיוניים של מיקרו-סביבת הגידול, כגון נישה סטרומלית, תאים חיסוניים הקשורים וכלי דם מחוררים, שהם גורמי מפתח של עמידות טיפולית והתקדמות המחלה. לפיכך, מערכת מודל חדשה המחקה טוב יותר את המיקרו-סביבה האנושית של הגידול in vivo נחוצה כדי לשפר את התרגום הקליני של ממצאים פרה-קליניים.
תחום הנדסת הרקמות מתקדם במהירות, ומספק שיטות משופרות לחקר מחלות אנושיות בתנאי מעבדה. התפתחות משמעותית אחת היא הופעתן של מערכות מיקרופיזיולוגיות (MPS), הידועות גם בשם שבבי איברים או שבבי רקמות, שהם איברים אנושיים פונקציונליים וממוזערים המסוגלים לשכפל מצבים בריאים או חולים 3,4,5. בהקשר זה, שבבי גידול, שהם מודלים תלת מימדיים מבוססי מיקרופלואידים במבחנה של גידולים אנושיים, פותחו עבור מחקר אונקולוגי 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . מודלים מתקדמים אלה משלבים רמזים ביוכימיים וביופיזיים בתוך מיקרו-סביבה דינמית של גידול, ומאפשרים לחוקרים לחקור את התנהגות הגידול ואת תגובותיו לטיפולים בהקשר פיזיולוגי רלוונטי יותר. עם זאת, למרות התקדמות זו, קבוצות מעטות שילבו בהצלחה כלי דם חי ומתפקד, במיוחד כזה שדפוסים עצמיים בתגובה לזרימה פיזיולוגית 3,4,5,6. הכללתה של רשת כלי דם תפקודית היא חיונית מכיוון שהיא מאפשרת מידול מחסומים פיזיים המשפיעים על העברת תרופות או תאים, ביות תאים למיקרו-סביבות נפרדות ונדידה טרנסאנדותלית של גידולים, סטרומה ותאי מערכת החיסון. על ידי הכללת תכונה זו, שבב הגידול יכול לייצג טוב יותר את המורכבויות שנצפו במיקרו-סביבה של הגידול in vivo.
כדי לענות על צורך זה שלא נענה, פיתחנו פלטפורמה חדשנית לסינון תרופות המאפשרת לרשתות כלי מיקרו להיווצר בתוך מכשיר מיקרופלואידי 8,9,10,11,12,13,14,15,16. פלטפורמת שבבי איברי בסיס זו, המכונה מיקרו-איבר וסקולרי (VMO), ניתנת להתאמה כמעט לכל מערכת איברים כדי לשכפל את הפיזיולוגיה המקורית של הרקמה לצורך מידול מחלות, בדיקות סקר לתרופות ויישומי רפואה מותאמת אישית. VMOs נקבעים על ידי תרבית משותפת של תאי אנדותל יוצרי תאים שמקורם בתאים (ECFC-EC), HUVEC או iPSC-EC (להלן EC), ותאי סטרומה מרובים בחדר, כולל פיברובלסטים ריאתיים אנושיים רגילים (NHLF), אשר מעצבים מחדש את המטריצה, ופריציטים העוטפים ומייצבים את כלי הדם. ה-VMO יכול גם להתבסס כמערכת מודל לסרטן על ידי תרבית משותפת של תאי גידול עם הסטרומה הקשורה ליצירת מיקרו-גידול וסקולרי (VMT)8,9,10,11,12,13, או שבב גידול, מודל. באמצעות תרבית משותפת של סוגי תאים מרובים בסביבת זרימה דינמית, רשתות מיקרו-וסקולריות מחוררות יוצרות דה נובו בחדרי הרקמה של המכשיר, שם כלי הדם מווסתים באופן הדוק על ידי קצבי זרימה אינטרסטיציאליים14,15. המדיום מונע דרך התעלות המיקרופלואידיות של המכשיר על ידי ראש לחץ הידרוסטטי המספק לתאים הסובבים את תא הרקמה חומרי מזון אך ורק דרך כלי הדם הזעירים, עם מקדם חדירות של 1.2 x 10-7 ס”מ לשנייה, בדומה למה שנראה עבור נימים in vivo8.
השילוב של מיקרו-כלי דם בעלי ארגון עצמי במודל VMT מהווה פריצת דרך משמעותית מכיוון שהוא: 1) מחקה את המבנה והתפקוד של מסות גידול וסקולריות in vivo; 2) יכול למדל שלבים מרכזיים של גרורות, כולל אינטראקציות בין תאי גידול-אנדותל וסטרומה; 3) קובע מחסומים סלקטיביים פיזיולוגית לאספקת חומרים מזינים ותרופות, שיפור סינון תרופות; ו-4) מאפשר הערכה ישירה של תרופות בעלות יכולות אנטי-אנגיוגניות ואנטי-גרורתיות. על ידי שכפול אספקת in vivo של חומרים מזינים, תרופות ותאי חיסון במיקרו-סביבה תלת-ממדית מורכבת, פלטפורמת VMO/VMT היא מודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית שניתן להשתמש בו לביצוע בדיקות סקר של תרופות ולחקר סרטן, ביולוגיה של כלי דם או איברים ספציפיים. חשוב לציין, VMT תומך בצמיחה של סוגים שונים של גידולים, כולל סרטן המעי הגס, מלנומה, סרטן השד, גליובלסטומה, סרטן ריאות, קרצינומטוזיס הצפק, סרטן השחלות, וסרטן הלבלב 8,9,10,11,12,13. בנוסף להיותה זולה, מבוססת בקלות וערוכה לניסויים בתפוקה גבוהה, הפלטפורמה המיקרופלואידית תואמת אופטית לחלוטין לניתוח תמונה בזמן אמת של אינטראקציות גידול-סטרומה ותגובה לגירויים או טיפולים. כל סוג תא במערכת מסומן בסמן פלואורסצנטי שונה כדי לאפשר הדמיה ישירה ומעקב אחר התנהגות התא לאורך כל הניסוי, וליצור חלון למיקרו-סביבה הדינמית של הגידול. הראינו בעבר שה-VMT מודל בצורה נאמנה יותר גידול גידול in vivo, ארכיטקטורה, הטרוגניות, חתימות ביטוי גנים ותגובות לתרופות מאשר שיטות תרבית סטנדרטיות10. חשוב לציין, ה-VMT תומך בצמיחה ובמחקר של תאים שמקורם בחולה, כולל תאים סרטניים, אשר מדגים טוב יותר את הפתולוגיה של גידולי האב מאשר תרביות ספרואידים סטנדרטיות ומקדם עוד יותר את מאמצי הרפואה המותאמת אישית11. כתב יד זה מתאר את השיטות להקמת VMT, ומציג את התועלת שלו לחקר סרטן אנושי.
Protocol
Representative Results
Discussion
כמעט כל רקמה בגוף מקבלת חומרים מזינים וחמצן דרך כלי הדם, מה שהופך אותה למרכיב קריטי למידול מחלות מציאותי ולבדיקת תרופות במבחנה. יתר על כן, מספר ממאירויות ומצבי מחלה מוגדרים על ידי תפקוד לקוי של אנדותל כלי הדם וחדירות יתר3. יש לציין כי בסרטן, כלי הדם הקשורים לגידול הם לעתים ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לחברי מעבדתו של ד”ר כריסטופר יוז על תרומתם המוערכת להליכים המתוארים, כמו גם לשותפינו במעבדתו של ד”ר אברהם לי על עזרתם בעיצוב וייצור פלטפורמה. עבודה זו נתמכה על ידי המענקים הבאים: UG3/UH3 TR002137, R61/R33 HL154307, 1R01CA244571, 1R01 HL149748, U54 CA217378 (CCWH) ו-TL1 TR001415 and W81XWH2110393 (SJH).
Materials
| Fabrication | |||
| (3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95% | Sigma-Aldrich | 175617-100G | |
| Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates | Greiner Bio-One | 655096 | |
| Methanol ≥99.8% ACS | VWR Chemicals BDH | BDH1135-1LP | |
| MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter, | Integra Miltex | 33-31AA-P/25 | |
| PDMS membrane | PAX Industries | HT-6240 | |
| Plasma Cleaner PDC-001 | Harrick Plasma | N/A | |
| Smooth-Cast 385 | Smooth-On | N/A | |
| SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator | Bel-Art | F42400-4031 | |
| Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate | VWR | 82050-827 | |
| SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS) | Dow | 4019862 | |
| Cell culture/Loading | |||
| BioTek Lionheart FX Automated Microscope | Agilent | CYT5MFAW | |
| CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells | StemBioSys | N/A | |
| Collagen I, rat tail | Enzo Life Sciences | ||
| Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4) | Sigma-Aldrich | C5138 | |
| Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium | Corning | 21-021-CV | |
| Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate | Corning | 10013CV | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190144 | |
| EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit | Lonza | CC-3162 | |
| Fibrinogen from bovine plasma | Neta Scientific | SIAL-341573 | |
| Fibronectin human plasma | Sigma-Aldrich | F0895 | |
| Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa) | Sigma-Aldrich | FD70S-1G | |
| Gelatin from porcine skin | Sigma-Aldrich | G1890 | |
| Hyaluronidase from sheep testes (type 4) | Sigma-Aldrich | H6254 | |
| Laminin Mouse Protein | Gibco | 23017015 | |
| Leica TCS SP8 | Leica | N/A | |
| MDA-MB-231 | ATCC | HTB-26 | |
| NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts | Lonza | CC-2512 | |
| Nikon Eclipse Ti | Nikon | N/A | |
| Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4 | Electron Microscopy Sciences | 15735-90-1L | |
| PBMCs – Peripheral blood mononuclear cells | Lonza | CC-2702 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010049 | |
| Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Avantor Seradigm | 97068-091 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | Invitrogen | P10144 | |
| Quick-RNA Microprep Kit | Zymo Research | R1051 | |
| Thrombin from bovine plasma | Sigma-Aldrich | T4648 | |
| Triton X-100 (Electrophoresis), | Fisher BioReagents | BP151-100 | |
| TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red | Gibco | 12605028 | |
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300062 | |
| Vasculife | Lifeline Cell Technology | LL-0003 |
References
- Siegel, R. L., Miller, K. D., Wagle, N. S., Jemal, A. Cancer statistics, 2023. CA Cancer J Clin. 73 (1), 17-48 (2023).
- Hachey, S. J., Hughes, C. C. W. Applications of tumor chip technology. Lab Chip. 18 (19), 2893-2912 (2018).
- Ewald, M. L., Chen, Y. H., Lee, A. P., Hughes, C. C. W. The vascular niche in next generation microphysiological systems. Lab Chip. 21 (17), 3615-3616 (2021).
- Osaki, T., Sivathanu, V., Kamm, R. D. Vascularized microfluidic organ-chips for drug screening, disease models and tissue engineering. Curr Opin Biotechnol. 52, 116-123 (2018).
- Shirure, V. S., Hughes, C. C. W., George, S. C. Engineering vascularized organoid-on-a-chip models. Annu Rev Biomed Eng. 23, 141-167 (2021).
- Del Piccolo, N., et al. Tumor-on-chip modeling of organ-specific cancer and metastasis. Adv Drug Deliv Rev. 175, 113798 (2021).
- Sontheimer-Phelps, A., Hassell, B. A., Ingber, D. E. Modelling cancer in microfluidic human organs-on-chips. Nat Rev Cancer. 19 (2), 65-81 (2019).
- Sobrino, A., et al. 3D microtumors in vitro supported by perfused vascular networks. Sci Rep. 6, 31589 (2016).
- Phan, D. T. T., et al. A vascularized and perfused organ-on-a-chip platform for large-scale drug screening applications. Lab Chip. 17 (3), 511-520 (2017).
- Hachey, S. J., et al. An in vitro vascularized micro-tumor model of human colorectal cancer recapitulates in vivo responses to standard-of-care therapy. Lab Chip. 21 (7), 1333-1351 (2021).
- Hachey, S. J., et al. A Human Vascularized Micro-Tumor Model of Patient-Derived Colorectal Cancer Recapitulates Clinical Disease. Transl Res. 255, 97-108 (2023).
- Liu, Y., et al. Human in vitro vascularized micro-organ and micro-tumor models are reproducible organ-on-a-chip platforms for studies of anticancer drugs. Toxicology. 445, 152601 (2020).
- Jahid, S., et al. Structure-based Design of CDC42 Effector Interaction Inhibitors for the Treatment of Cancer. Cell Rep. 39 (4), 110760 (2022).
- Hsu, Y. H., Moya, M. L., Hughes, C. C. W., George, S. C., Lee, A. P. A microfluidic platform for generating large-scale nearly identical human microphysiological vascularized tissue arrays. Lab Chip. 13 (15), 2990-2998 (2013).
- Moya, M. L., Hsu, Y. H., Lee, A. P., Christopher, C. W. H., George, S. C. In vitro perfused human capillary networks. Tissue Eng – Part C: Methods. 19 (9), 730-737 (2013).
- Wang, X., et al. An on-chip microfluidic pressure regulator that facilitates reproducible loading of cells and hydrogels into microphysiological system platforms. Lab Chip. 16 (5), 868-876 (2016).
- Phan, D. T., et al. Blood-brain barrier-on-a-chip: Microphysiological systems that capture the complexity of the blood-central nervous system interface. Exp Biol Med. 242 (17), 1669-1678 (2017).
- Kurokawa, Y. K., et al. Human induced pluripotent stem cell-derived endothelial cells for three-dimensional microphysiological systems. Tissue Eng Part C: Methods. 23 (8), 474-484 (2017).
- Romero-López, M., et al. Recapitulating the human tumor microenvironment: Colon tumor-derived extracellular matrix promotes angiogenesis and tumor cell growth. Biomaterials. 116, 118-129 (2017).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Carpenter, A. E., et al. CellProfiler: Image analysis software for identifying and quantifying cell phenotypes. Genome Biol. 7 (10), R100 (2006).
- Zudaire, E., Gambardella, L., Kurcz, C., Vermeren, S. A computational tool for quantitative analysis of vascular networks. PLoS one. 6 (11), e27385 (2011).
- Corliss, B. A., et al. REAVER: A program for improved analysis of high-resolution vascular network images. Microcirculation. 27 (5), e12618 (2020).
- Urban, G., et al. Deep learning for drug discovery and cancer research: Automated analysis of vascularization images. IEEE/ACM Trans Comput Biol Bioinform. 16 (3), 1029-1035 (2019).
