Summary

Cryoconservation de cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines au stade optimal

Published: November 03, 2023
doi:

Summary

Cette étude fournit un protocole détaillé pour la cryoconservation efficace des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes dérivées de cellules souches humaines.

Abstract

Les cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes (EPR) dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont des sources cellulaires supérieures pour la thérapie de remplacement cellulaire chez les personnes atteintes de maladies dégénératives de la rétine. Cependant, les études sur la mise en banque stable et sûre de ces cellules thérapeutiques sont rares. La viabilité cellulaire très variable et la récupération fonctionnelle des cellules EPR après cryoconservation sont les problèmes les plus fréquemment rencontrés. Dans le protocole actuel, nous avons cherché à obtenir le meilleur taux de récupération cellulaire après décongélation en sélectionnant la phase cellulaire optimale pour la congélation en fonction des conditions expérimentales d’origine. Les cellules ont été congelées dans la phase exponentielle déterminée à l’aide du test de marquage de la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine, ce qui a amélioré la viabilité cellulaire et le taux de récupération après décongélation. Des cellules stables et fonctionnelles ont été obtenues peu de temps après la décongélation, indépendamment d’un long processus de différenciation. Les méthodes décrites ici permettent la conservation et la décongélation simples, efficaces et peu coûteuses des cellules RPE dérivées d’ESCh. Bien que ce protocole se concentre sur les cellules RPE, cette stratégie de congélation peut être appliquée à de nombreux autres types de cellules différenciées.

Introduction

L’épithélium pigmentaire rétinien (EPR) est une monocouche pigmentée de cellules nécessaires au maintien du bon fonctionnement de la rétine1. Le dysfonctionnement et la mort de l’EPR sont étroitement associés à de nombreuses maladies dégénératives de la rétine, notamment la dégénérescence maculaire liée à l’âge, la rétinite pigmentaire et la maladie de Stargardt 2,3. La thérapie de remplacement de l’EPR est l’un des schémas thérapeutiques les plus prometteurs pour ces maladies 4,5,6,7. Un approvisionnement stable en cellules EPR de donneur est essentiel pour la thérapie cellulaire. Les cellules EPR dérivées de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) sont une source cellulaire idéale pour la thérapie cellulaire car elles imitent la fonction des cellules EPR primaires et peuvent produire un approvisionnement théoriquement illimité8. Cependant, le processus de différenciation est laborieux et la durée de conservation des cellules EPR obtenues est relativement courte en raison de la transition épithélio-mésenchymateuse (EMT) ultérieure. Par conséquent, la cryoconservation des cellules EPR dérivées de CSEh est une étape indispensable nécessaire au stockage à long terme et à la distribution à la demande9.

Les dommages cellulaires induits par la cryoconservation peuvent compromettre par inadvertance l’efficacité thérapeutique10,11. Par conséquent, des études récentes sur la cryoconservation ont suggéré que les conditions optimales de stockage cryogénique devraient être déterminées lors de la conception de thérapies cellulaires12. Une cryoconservation réussie garantit une récupération efficace des cellules, une viabilité élevée et la restauration de la fonction cellulaire après le cycle de congélation-décongélation. Cependant, des études antérieures sur la cryoconservation des monocouches adhérentes de cellules de mammifères ont rapporté des taux de survie très variables (35%-95%) après décongélation 13,14,15. De nombreux facteurs affectent considérablement les résultats de la cryoconservation, en particulier pendant l’étape de congélation16,17. Des recherches récentes ont montré que les cellules EPR congelées à différents moments présentaient une récupération variée après décongélation17. À notre connaissance, il n’existe pas d’études sur la détermination de la fenêtre de temps de congélation optimale pour les cellules EPR dérivées de cellules souches. Dans différentes études, les cellules ont été congelées à différents stades : certaines cellules ont été congelées peu de temps après le passage ou avant la confluence ou la pigmentation 8,15,18, tandis que d’autres ont été congelées à d’autres moments 9,19,20,21. De plus, il n’existe aucune preuve claire indiquant si la phase ou l’étape des cellules EPR utilisées pour la cryoconservation affecte la fonction de l’EPR après la décongélation. Dans notre étude précédente, nous avons démontré pour la première fois que la phase exponentielle de croissance cellulaire (P2D5) est la meilleure étape pour la cryoconservation des cellules EPR dérivées de hESC en termes de viabilité cellulaire et de récupération des propriétés et fonctions cellulaires17.

La méthode établie ici vise à cryoconserver les EPR dérivés de hESC à un stade optimal pour obtenir la meilleure conservation en termes de viabilité cellulaire et de fonction après décongélation. À l’aide du test de marquage à la 5-éthynyl-2′-désoxyuridine (EdU) pour détecter la phase exponentielle de la synthèse de l’ADN avant la cryoconservation, les cellules EPR décongelées ont présenté une viabilité et un taux d’attachement de >80 %, une expression génique spécifique de l’EPR, une morphologie cellulaire polarisée, une sécrétion de facteurs dérivés de l’épithélium pigmentaire, une résistance transépithéliale appropriée et une capacité phagocytaire 8,17,22. Bien que ce protocole se concentre sur les cellules RPE dérivées de hESC et que toutes les cellules thérapeutiques ne soient pas cryopréservées de la même manière, la stratégie de congélation en phase exponentielle peut être appliquée à de nombreuses autres cellules thérapeutiques.

Protocol

1. Dissociation cellulaire Maintenir les cellules EPR comme décrit précédemment 17,22.REMARQUE : Toutes les cellules sont cultivées à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2 pendant toute la durée des protocoles. Préparez la quantité requise de PBS et de milieu de culture dans un bain-marie à 37°C et placez le réactif de dissociation cellulaire à température ambiante. Jeter la solution d…

Representative Results

Ici, les cellules EPR dérivées de CSEh à P1D35 ont été passées et ensemencées à une densité de 105/cm2. Dans la semaine qui a suivi l’ensemencement, la morphologie hexagonale et la pigmentation caractéristiques ont été perdues pendant la phase de latence (environ 2 jours). Les cellules de l’EPR ont progressivement réadopté la morphologie hexagonale dans la phase exponentielle (environ 5 jours, Figure 1A) et sont entrées dans la phase de décélératio…

Discussion

Dans la présente étude, un protocole de congélation-décongélation efficace pour les cellules EPR dérivées de CSEh pour la recherche et les besoins cliniques est décrit. Contrairement à la lignée cellulaire APR immortalisée, ARPE-19, les cellules EPR avec un phénotype et une fonction épithéliales caractéristiques appropriés, comme les cellules EPR dérivées de cellules souches, sont plus sensibles à la cryoconservation. Moins de 32 % des cellules sont restées à 24 h après la décongélation si elles n…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (81970816) à Mei Jiang ; la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82201223) à Xinyue Zhu ; et le Plan d’action pour l’innovation scientifique et technologique de la Commission de Shanghai pour la science et la technologie (2014090067000) à Haiyun Liu.

Materials

40 μm Cell strainer Corning 431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye Thermo Fisher Scientific C10337
Cryo freezing container Nalgene 5100-0001
CryoStor CS10 Biolife Solutions 07930 cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190144
Genxin Selcell YB050050 cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells provided by Wicell, USA H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix Corning 354277 basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System BioLife Solutions AST-601
Trypan Blue solution 0.4% Sigma T8154
TryPLE Select Thermo Fisher Scientific 12563029 cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium Lonza BEBP04-743Q RPE culture medium
Y-27632 Selleck S1049

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Bai, X., Zhang, T., Zhu, X., Huang, X., Liu, H., Ding, X., Jiang, M., Sun, X. Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage. J. Vis. Exp. (201), e65888, doi:10.3791/65888 (2023).

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