Criopreservación de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre embrionarias humanas en la etapa óptima
Summary
Este estudio proporciona un protocolo detallado para la criopreservación eficiente de células epiteliales pigmentarias de la retina derivadas de células madre humanas.
Abstract
Las células epiteliales pigmentarias de la retina (EPR) derivadas de células madre embrionarias humanas (hESCs) son fuentes celulares superiores para la terapia de reemplazo celular en individuos con enfermedades degenerativas de la retina; Sin embargo, los estudios sobre el almacenamiento estable y seguro de estas células terapéuticas son escasos. La viabilidad celular altamente variable y la recuperación funcional de las células EPR después de la criopreservación son los problemas más comunes. En el protocolo actual, nuestro objetivo fue lograr la mejor tasa de recuperación celular después de la descongelación seleccionando la fase celular óptima para la congelación en función de las condiciones experimentales originales. Las células se congelaron en la fase exponencial determinada mediante el ensayo de marcaje con 5-etinil-2′-desoxiuridina, que mejoró la viabilidad celular y la tasa de recuperación después de la descongelación. Las células estables y funcionales se obtuvieron poco después de la descongelación, independientemente de un largo proceso de diferenciación. Los métodos descritos aquí permiten la conservación y descongelación simples, eficientes y económicas de las células RPE derivadas de hESC. Aunque este protocolo se centra en las células EPR, esta estrategia de congelación puede aplicarse a muchos otros tipos de células diferenciadas.
Introduction
El epitelio pigmentario de la retina (EPR) es una monocapa pigmentada de células necesarias para mantener el correcto funcionamiento de la retina. La disfunción y la muerte del EPR están estrechamente asociadas con muchas enfermedades degenerativas de la retina, como la degeneración macular relacionada con la edad, la retinosis pigmentaria y la enfermedad de Stargardt 2,3. La terapia de reemplazo del EPR es uno de los esquemas de tratamiento más prometedores para estas enfermedades 4,5,6,7. Un suministro estable de células RPE del donante es vital para la terapia celular. Las células EPR derivadas de células madre embrionarias humanas (hESC) son una fuente celular ideal para la terapia celular porque imitan la función de las células primarias EPR y pueden producir un suministro teóricamente ilimitado8. Sin embargo, el proceso de diferenciación es laborioso y la vida útil de las células EPR obtenidas es relativamente corta debido a la posterior transición epitelio-mesenquimal (EMT). Por lo tanto, la criopreservación de células EPR derivadas de hESC es un paso indispensable necesario para el almacenamiento a largo plazo y la distribución bajo demanda9.
El daño celular inducido por la criopreservación puede comprometer inadvertidamente la eficacia terapéutica 10,11. Por lo tanto, estudios recientes sobre criopreservación han propuesto que las condiciones óptimas de almacenamiento criogénico deben determinarse al diseñar terapias celulares12. La criopreservación exitosa garantiza una recuperación celular eficiente, alta viabilidad y restauración de la función celular después del ciclo de congelación-descongelación. Sin embargo, estudios previos sobre la criopreservación de las monocapas adherentes de células de mamíferos han reportado tasas de supervivencia altamente variables (35%-95%) después de la descongelación 13,14,15. Muchos factores afectan considerablemente los resultados de la criopreservación, particularmente durante la etapa de congelación16,17. Investigaciones recientes mostraron que las células EPR congeladas en diferentes puntos de tiempo exhibieron una recuperación variada después de la descongelación17. Hasta donde sabemos, faltan estudios sobre la determinación de la ventana de tiempo de congelación óptima para las células RPE derivadas de células madre. En diferentes estudios, las células se congelaron en varias etapas: algunas células se congelaron poco después del paso o antes de la confluencia o pigmentación 8,15,18, mientras que otras se congelaron en otros puntosde tiempo 9,19,20,21. Además, no hay pruebas claras de si la fase o el estadio de las células EPR utilizadas para la criopreservación afectan a la función del EPR después de la descongelación. En nuestro estudio anterior, demostramos por primera vez que la fase exponencial de crecimiento celular (P2D5) es la mejor etapa para la criopreservación de células EPR derivadas de hESC en términos de viabilidad celular y recuperación de propiedades y funciones celulares17.
El método establecido aquí tiene como objetivo criopreservar el EPR derivado de hESC en una etapa óptima para lograr la mejor preservación en términos de viabilidad y función celular después de la descongelación. Utilizando el ensayo de marcaje de 5-etinil-2′-desoxiuridina (EdU) para detectar la fase exponencial de la síntesis de ADN antes de la criopreservación, las células de EPR descongeladas mostraron una tasa de viabilidad y adhesión del >80%, expresión génica específica de EPR, morfología celular polarizada, secreción de factor derivada del epitelio pigmentario, resistencia transepitelial adecuada y capacidad fagocítica 8,17,22. Aunque este protocolo se centra en las células EPR derivadas de hESC y no todas las células terapéuticas son igualmente criopreservadas, la estrategia de congelación en la fase exponencial puede aplicarse a muchas otras células terapéuticas.
Protocol
Representative Results
Discussion
En el presente estudio, se describe un protocolo exitoso de congelación-descongelación para células RPE derivadas de hESC para necesidades clínicas y de investigación. A diferencia de la línea celular de EPR inmortalizada, ARPE-19, las células EPR con el fenotipo epitelial y la función característicos adecuados, como las células EPR derivadas de células madre, son más sensibles a la criopreservación. Menos del 32% de las células permanecieron a las 24 h después de la descongelación si no se conservaban ad…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue financiado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81970816) a Mei Jiang; la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82201223) a Xinyue Zhu; y el Plan de Acción de Innovación Científica y Tecnológica de la Comisión de Ciencia y Tecnología de Shanghái (2014090067000) a Haiyun Liu.
Materials
| 40 μm Cell strainer | Corning | 431750 | |
| Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
| Cryo freezing container | Nalgene | 5100-0001 | |
| CryoStor CS10 | Biolife Solutions | 07930 | cryopreservation medium #1 |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
| Genxin | Selcell | YB050050 | cryopreservation medium #2 |
| Human embryonic stem cells | provided by Wicell, USA | H9 cell line | |
| Matrigel, hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | basement membrane matrix |
| ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System | BioLife Solutions | AST-601 | |
| Trypan Blue solution 0.4% | Sigma | T8154 | |
| TryPLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | cell dissociation reagent |
| XVIVO-10 medium | Lonza | BEBP04-743Q | RPE culture medium |
| Y-27632 | Selleck | S1049 |
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