Summary

Kryokonservering av humana embryonala stamcellshärledda retinala pigmentepitelceller i det optimala stadiet

Published: November 03, 2023
doi:

Summary

Denna studie ger ett detaljerat protokoll för effektiv kryokonservering av humana stamcellshärledda retinala pigmentepitelceller.

Abstract

Retinala pigmentepitelceller (RPE) som härrör från humana embryonala stamceller (hESC) är överlägsna cellkällor för cellersättningsterapi hos individer med retinala degenerativa sjukdomar; Studier på den stabila och säkra bankningen av dessa terapeutiska celler är dock knapphändiga. Mycket varierande cellviabilitet och funktionell återhämtning av RPE-celler efter kryokonservering är de vanligaste problemen. I det nuvarande protokollet strävade vi efter att uppnå den bästa cellåterhämtningshastigheten efter upptining genom att välja den optimala cellfasen för frysning baserat på de ursprungliga experimentella förhållandena. Cellerna frystes i den exponentiella fasen som bestämdes med hjälp av 5-etynyl-2′-deoxiuridinmärkningsanalysen, vilket förbättrade cellviabiliteten och återhämtningshastigheten efter upptining. Stabila och funktionella celler erhölls kort efter upptining, oberoende av en lång differentieringsprocess. Metoderna som beskrivs här möjliggör enkel, effektiv och billig konservering och upptining av hESC-härledda RPE-celler. Även om detta protokoll fokuserar på RPE-celler, kan denna frysningsstrategi tillämpas på många andra typer av differentierade celler.

Introduction

Det retinala pigmentepitelet (RPE) är ett pigmenterat monolager av celler som krävs för att upprätthålla näthinnanskorrekta funktion 1. RPE-dysfunktion och död är nära förknippade med många retinala degenerativa sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration, retinitis pigmentosa och Stargardts sjukdom 2,3. RPE-substitutionsterapi är en av de mest lovande behandlingsregimerna för dessa sjukdomar 4,5,6,7. En stabil tillgång på donerade RPE-celler är avgörande för cellterapi. RPE-celler från mänskliga embryonala stamceller (hESC) är en idealisk cellkälla för cellterapi eftersom de efterliknar funktionen hos primära RPE-celler och kan producera en teoretiskt obegränsad tillgång8. Differentieringsprocessen är dock mödosam och hållbarheten för de erhållna RPE-cellerna är relativt kort på grund av den efterföljande epitelial-mesenkymala övergången (EMT). Därför är kryokonservering av hESC-härledda RPE-celler ett oumbärligt steg som krävs för långtidslagring och distribution på begäran9.

Kryokonserveringsinducerad cellulär skada kan oavsiktligt äventyra den terapeutiska effekten10,11. Därför har nyligen genomförda studier om kryokonservering föreslagit att optimala kryogena lagringsförhållanden bör bestämmas vid utformning av cellterapier12. Framgångsrik kryokonservering garanterar effektiv cellåterhämtning, hög livskraft och återställning av cellfunktionen efter frys-upptiningscykeln. Tidigare studier av kryokonservering av de vidhäftande monolagren av däggdjursceller har dock rapporterat mycket varierande (35%-95%) överlevnadsgrad efter upptining 13,14,15. Många faktorer påverkar avsevärt resultaten av kryokonservering, särskilt under frysningsstadiet 16,17. Ny forskning visade att RPE-celler som frysts vid olika tidpunkter uppvisade varierad återhämtning efter upptiningav 17. Såvitt vi vet saknas studier om bestämning av det optimala frystidsfönstret för stamcellshärledda RPE-celler. I olika studier frystes cellerna i olika skeden: vissa celler frystes strax efter passage eller före sammanflöde eller pigmentering 8,15,18, medan andra frystes vid andra tidpunkter 9,19,20,21. Dessutom finns det inga tydliga bevis för om fasen eller stadiet av RPE-celler som används för kryokonservering påverkar RPE-funktionen efter upptining. I vår tidigare studie visade vi för första gången att den exponentiella fasen av celltillväxt (P2D5) är det bästa stadiet för kryokonservering av hESC-härledda RPE-celler när det gäller cellviabilitet och återhämtning av cellulära egenskaper och funktioner17.

Metoden som etableras här syftar till att kryokonservera hESC-härledd RPE i ett optimalt skede för att uppnå bästa bevarande när det gäller cellviabilitet och funktion efter upptining. Genom att använda 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) märkningsanalys för att detektera den exponentiella fasen av DNA-syntesen före kryokonservering, uppvisade tinade RPE-celler >80 % viabilitet och bindningshastighet, RPE-specifikt genuttryck, polariserad cellmorfologi, utsöndring av pigmentepitelhärledda faktorer, lämplig transepitelresistens och fagocytisk förmåga 8,17,22. Även om detta protokoll fokuserar på hESC-härledda RPE-celler och inte alla terapeutiska celler är lika kryokonserverade, kan strategin med frysning i exponentialfasen tillämpas på många andra terapeutiska celler.

Protocol

1. Dissociation av celler Underhåll RPE-celler som tidigare beskrivits 17,22.OBS: Alla celler odlas vid 37 °C i en 5 % CO2 atmosfär under hela protokollens varaktighet. Förbered erforderlig mängd PBS och odlingsmedium i ett 37 ° C vattenbad och placera celldissociationsreagenset vid rumstemperatur. Kassera odlingslösningen och tvätta plattorna två gånger med 1 ml förvärmd PBS per brunn.</li…

Representative Results

Här passerade hESC-härledda RPE-celler vid P1D35 och såddes med en densitet av 105/cm2. Inom en vecka efter sådd förlorades den karakteristiska hexagonala morfologin och pigmenteringen under fördröjningsfasen (cirka 2 dagar). RPE-celler återtog gradvis den hexagonala morfologin i den exponentiella fasen (cirka 5 dagar, figur 1A) och gick in i retardationsfasen (cirka 6 dagar) med en mer polygonal morfologi. Om cellodlingen fortsatte i ytterligare en vecka minska…

Discussion

I den aktuella studien beskrivs ett framgångsrikt frys-upptiningsprotokoll för hESC-härledda RPE-celler för forskning och kliniska behov. Till skillnad från den odödliga RPE-cellinjen, ARPE-19, är RPE-celler med korrekt karakteristisk epitelfenotyp och funktion, liksom stamcellshärledda RPE-celler, mer känsliga för kryokonservering. Mindre än 32 % av cellerna fanns kvar 24 timmar efter upptining om deinte bevarades på rätt sätt. Tidpunkten för kryokonservering är en kritisk paramet…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (81970816) till Mei Jiang; Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (82201223) till Xinyue Zhu; och handlingsplanen för vetenskap och teknisk innovation från Shanghai Science and Technology Commission (2014090067000) till Haiyun Liu.

Materials

40 μm Cell strainer Corning 431750
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye Thermo Fisher Scientific C10337
Cryo freezing container Nalgene 5100-0001
CryoStor CS10 Biolife Solutions 07930 cryopreservation medium #1
DPBS, no calcium, no magnesium Thermo Fisher Scientific 14190144
Genxin Selcell YB050050 cryopreservation medium #2
Human embryonic stem cells provided by Wicell, USA H9 cell line
Matrigel, hESC-Qualified Matrix Corning 354277 basement membrane matrix
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System BioLife Solutions AST-601
Trypan Blue solution 0.4% Sigma T8154
TryPLE Select Thermo Fisher Scientific 12563029 cell dissociation reagent
XVIVO-10 medium Lonza BEBP04-743Q RPE culture medium
Y-27632 Selleck S1049

References

  1. Lakkaraju, A., et al. The cell biology of the retinal pigment epithelium. Progress in Retinal and Eye Research. 78, 100846 (2020).
  2. Mcbain, V. A., Townend, J., Lois, N. Progression of retinal pigment epithelial atrophy in stargardt disease. American Journal of Ophthamology. 154 (1), 146-154 (2012).
  3. George, S. M., Lu, F., Rao, M., Leach, L. L., Gross, J. M. The retinal pigment epithelium: Development, injury responses, and regenerative potential in mammalian and non-mammalian systems. Progress in Retinal and Eye Research. 85, 100969 (2021).
  4. Rizzolo, L. J., Nasonkin, I. O., Adelman, R. A. Retinal cell transplantation, biomaterials, and in vitro models for developing next-generation therapies of age-related macular degeneration. Stem Cells Translational Medicine. 11 (3), 269-281 (2022).
  5. Bertolotti, E., Neri, A., Camparini, M., Macaluso, C., Marigo, V. Stem cells as source for retinal pigment epithelium transplantation. Progress in Retinal and Eye Research. 42, 130-144 (2014).
  6. Da Cruz, ., L, , et al. Phase 1 clinical study of an embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelium patch in age-related macular degeneration. Nature Biotechnology. 36 (4), 328-337 (2018).
  7. Mehat, M. S., et al. Transplantation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells in macular degeneration. Ophthalmology. 125 (11), 1765-1775 (2018).
  8. Buchholz, D. E., et al. Rapid and efficient directed differentiation of human pluripotent stem cells into retinal pigmented epithelium. Stem Cells Translational Medicine. 2 (5), 384-393 (2013).
  9. Li, Q. -. Y., et al. Functional assessment of cryopreserved clinical grade hESC-RPE cells as a qualified cell source for stem cell therapy of retinal degenerative diseases. Experimental Eye Research. 202, 108305 (2021).
  10. Francois, M., et al. Cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunosuppressive properties as a result of heat-shock response and impaired interferon-gamma licensing. Cytotherapy. 14 (2), 147-152 (2012).
  11. Moll, G., et al. Do cryopreserved mesenchymal stromal cells display impaired immunomodulatory and therapeutic properties. Stem Cells. 32 (9), 2430-2442 (2014).
  12. Ekpo, M. D., et al. Incorporating cryopreservation evaluations into the design of cell-based drug delivery systems: an opinion paper. Frontiers in Immunology. 13, 967731 (2022).
  13. Bailey, T. L., et al. Protective effects of osmolytes in cryopreserving adherent neuroblastoma (Neuro-2a) cells. Cryobiology. 71 (3), 472-480 (2015).
  14. Okumura, N., et al. Feasibility of a cryopreservation of cultured human corneal endothelial cells. PLoS One. 14 (6), e0218431 (2019).
  15. Pennington, B. O., et al. Xeno-free cryopreservation of adherent retinal pigmented epithelium yields viable and functional cells in vitro and in vivo. Scientific Reports. 11 (1), 6286 (2021).
  16. Woods, E. J., Thirumala, S., Badhe-Buchanan, S. S., Clarke, D., Mathew, A. J. Off the shelf cellular therapeutics: Factors to consider during cryopreservation and storage of human cells for clinical use. Cytotherapy. 18 (6), 697-711 (2016).
  17. Zhang, T., et al. Determining the optimal stage for cryopreservation of human embryonic stem cell-derived retinal pigment epithelial cells. Stem Cell Research & Therapy. 13 (1), 454 (2022).
  18. Leach, L. L., et al. Induced pluripotent stem cell-derived retinal pigmented epithelium: a comparative study between cell lines and differentiation Methods. Journal of Ocular Pharmacology and Therapeutics. 32 (5), 317-330 (2016).
  19. Reichman, S., et al. Generation of storable retinal organoids and retinal pigmented epithelium from adherent human iPS cells in Xeno-free and feeder-free conditions. Stem Cells. 35 (5), 1176-1188 (2017).
  20. Brandl, C., et al. In-depth characterisation of retinal pigment epithelium (RPE) cells derived from human induced pluripotent stem cells (hiPSC). Neuromolecular Medicine. 16 (3), 551-564 (2014).
  21. Hongisto, H., Ilmarinen, T., Vattulainen, M., Mikhailova, A., Skottman, H. Xeno- and feeder-free differentiation of human pluripotent stem cells to two distinct ocular epithelial cell types using simple modifications of one method. Stem Cell Research & Therapy. 8 (1), 291 (2017).
  22. Foltz, L. P., Clegg, D. O. Rapid, directed differentiation of retinal pigment epithelial cells from human embryonic or induced pluripotent stem cells. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (128), 10.3791/56274 (2017).
  23. Marcantonini, G., et al. Natural cryoprotective and cytoprotective agents in cryopreservation: a focus on melatonin. Molecules. 27 (10), 3254 (2022).

Play Video

Cite This Article
Bai, X., Zhang, T., Zhu, X., Huang, X., Liu, H., Ding, X., Jiang, M., Sun, X. Cryopreservation of Human Embryonic Stem Cell-Derived Retinal Pigment Epithelial Cells at the Optimal Stage. J. Vis. Exp. (201), e65888, doi:10.3791/65888 (2023).

View Video