Denna studie ger ett detaljerat protokoll för effektiv kryokonservering av humana stamcellshärledda retinala pigmentepitelceller.
Retinala pigmentepitelceller (RPE) som härrör från humana embryonala stamceller (hESC) är överlägsna cellkällor för cellersättningsterapi hos individer med retinala degenerativa sjukdomar; Studier på den stabila och säkra bankningen av dessa terapeutiska celler är dock knapphändiga. Mycket varierande cellviabilitet och funktionell återhämtning av RPE-celler efter kryokonservering är de vanligaste problemen. I det nuvarande protokollet strävade vi efter att uppnå den bästa cellåterhämtningshastigheten efter upptining genom att välja den optimala cellfasen för frysning baserat på de ursprungliga experimentella förhållandena. Cellerna frystes i den exponentiella fasen som bestämdes med hjälp av 5-etynyl-2′-deoxiuridinmärkningsanalysen, vilket förbättrade cellviabiliteten och återhämtningshastigheten efter upptining. Stabila och funktionella celler erhölls kort efter upptining, oberoende av en lång differentieringsprocess. Metoderna som beskrivs här möjliggör enkel, effektiv och billig konservering och upptining av hESC-härledda RPE-celler. Även om detta protokoll fokuserar på RPE-celler, kan denna frysningsstrategi tillämpas på många andra typer av differentierade celler.
Det retinala pigmentepitelet (RPE) är ett pigmenterat monolager av celler som krävs för att upprätthålla näthinnanskorrekta funktion 1. RPE-dysfunktion och död är nära förknippade med många retinala degenerativa sjukdomar, inklusive åldersrelaterad makuladegeneration, retinitis pigmentosa och Stargardts sjukdom 2,3. RPE-substitutionsterapi är en av de mest lovande behandlingsregimerna för dessa sjukdomar 4,5,6,7. En stabil tillgång på donerade RPE-celler är avgörande för cellterapi. RPE-celler från mänskliga embryonala stamceller (hESC) är en idealisk cellkälla för cellterapi eftersom de efterliknar funktionen hos primära RPE-celler och kan producera en teoretiskt obegränsad tillgång8. Differentieringsprocessen är dock mödosam och hållbarheten för de erhållna RPE-cellerna är relativt kort på grund av den efterföljande epitelial-mesenkymala övergången (EMT). Därför är kryokonservering av hESC-härledda RPE-celler ett oumbärligt steg som krävs för långtidslagring och distribution på begäran9.
Kryokonserveringsinducerad cellulär skada kan oavsiktligt äventyra den terapeutiska effekten10,11. Därför har nyligen genomförda studier om kryokonservering föreslagit att optimala kryogena lagringsförhållanden bör bestämmas vid utformning av cellterapier12. Framgångsrik kryokonservering garanterar effektiv cellåterhämtning, hög livskraft och återställning av cellfunktionen efter frys-upptiningscykeln. Tidigare studier av kryokonservering av de vidhäftande monolagren av däggdjursceller har dock rapporterat mycket varierande (35%-95%) överlevnadsgrad efter upptining 13,14,15. Många faktorer påverkar avsevärt resultaten av kryokonservering, särskilt under frysningsstadiet 16,17. Ny forskning visade att RPE-celler som frysts vid olika tidpunkter uppvisade varierad återhämtning efter upptiningav 17. Såvitt vi vet saknas studier om bestämning av det optimala frystidsfönstret för stamcellshärledda RPE-celler. I olika studier frystes cellerna i olika skeden: vissa celler frystes strax efter passage eller före sammanflöde eller pigmentering 8,15,18, medan andra frystes vid andra tidpunkter 9,19,20,21. Dessutom finns det inga tydliga bevis för om fasen eller stadiet av RPE-celler som används för kryokonservering påverkar RPE-funktionen efter upptining. I vår tidigare studie visade vi för första gången att den exponentiella fasen av celltillväxt (P2D5) är det bästa stadiet för kryokonservering av hESC-härledda RPE-celler när det gäller cellviabilitet och återhämtning av cellulära egenskaper och funktioner17.
Metoden som etableras här syftar till att kryokonservera hESC-härledd RPE i ett optimalt skede för att uppnå bästa bevarande när det gäller cellviabilitet och funktion efter upptining. Genom att använda 5-etynyl-2′-deoxiuridin (EdU) märkningsanalys för att detektera den exponentiella fasen av DNA-syntesen före kryokonservering, uppvisade tinade RPE-celler >80 % viabilitet och bindningshastighet, RPE-specifikt genuttryck, polariserad cellmorfologi, utsöndring av pigmentepitelhärledda faktorer, lämplig transepitelresistens och fagocytisk förmåga 8,17,22. Även om detta protokoll fokuserar på hESC-härledda RPE-celler och inte alla terapeutiska celler är lika kryokonserverade, kan strategin med frysning i exponentialfasen tillämpas på många andra terapeutiska celler.
I den aktuella studien beskrivs ett framgångsrikt frys-upptiningsprotokoll för hESC-härledda RPE-celler för forskning och kliniska behov. Till skillnad från den odödliga RPE-cellinjen, ARPE-19, är RPE-celler med korrekt karakteristisk epitelfenotyp och funktion, liksom stamcellshärledda RPE-celler, mer känsliga för kryokonservering. Mindre än 32 % av cellerna fanns kvar 24 timmar efter upptining om deinte bevarades på rätt sätt. Tidpunkten för kryokonservering är en kritisk paramet…
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete finansierades av National Natural Science Foundation of China (81970816) till Mei Jiang; Kinas nationella naturvetenskapliga stiftelse (82201223) till Xinyue Zhu; och handlingsplanen för vetenskap och teknisk innovation från Shanghai Science and Technology Commission (2014090067000) till Haiyun Liu.
40 μm Cell strainer | Corning | 431750 | |
Click-iT EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 488 Dye | Thermo Fisher Scientific | C10337 | |
Cryo freezing container | Nalgene | 5100-0001 | |
CryoStor CS10 | Biolife Solutions | 07930 | cryopreservation medium #1 |
DPBS, no calcium, no magnesium | Thermo Fisher Scientific | 14190144 | |
Genxin | Selcell | YB050050 | cryopreservation medium #2 |
Human embryonic stem cells | provided by Wicell, USA | H9 cell line | |
Matrigel, hESC-Qualified Matrix | Corning | 354277 | basement membrane matrix |
ThawSTAR CFT2 Automated Cell Thawing System | BioLife Solutions | AST-601 | |
Trypan Blue solution 0.4% | Sigma | T8154 | |
TryPLE Select | Thermo Fisher Scientific | 12563029 | cell dissociation reagent |
XVIVO-10 medium | Lonza | BEBP04-743Q | RPE culture medium |
Y-27632 | Selleck | S1049 |