Automatically Generated

Summary

Følgende protokoll presenterer deteksjon av enkeltstrenget DNA-foci i G1-fasen av cellesyklusen ved bruk av cellesyklussynkronisering etterfulgt av RPA2-immunfluorescerende farging.

Abstract

DNA har dedikerte cellulære reparasjonsveier som er i stand til å takle lesjoner som kan oppstå fra både endogene og / eller eksogene kilder. DNA-reparasjon krever samarbeid mellom mange proteiner, som er ansvarlige for å dekke et bredt spekter av oppgaver fra å gjenkjenne og signalisere tilstedeværelsen av en DNA-lesjon til fysisk reparasjon av den. Under denne prosessen opprettes ofte spor av enkeltstrenget DNA (ssDNA), som til slutt fylles av DNA-polymeraser. Naturen til disse ssDNA-sporene (både når det gjelder lengde og antall), sammen med polymerasen som rekrutteres for å fylle disse hullene, er reparasjonsveispesifikk. Visualiseringen av disse ssDNA-sporene kan hjelpe oss å forstå den kompliserte dynamikken til DNA-reparasjonsmekanismer.

Denne protokollen gir en detaljert metode for fremstilling av G1-synkroniserte celler for å måle ssDNA-focidannelse ved genotoksisk stress. Ved å bruke en brukervennlig immunfluorescenstilnærming, visualiserer vi ssDNA ved å farge for RPA2, en komponent i det heterotrimeriske replikasjonsproteinet A-kompleks (RPA). RPA2 binder seg til og stabiliserer ssDNA-mellomprodukter som oppstår ved genotoksisk stress eller replikasjon for å kontrollere DNA-reparasjon og aktivering av DNA-skadekontrollpunkt. 5-Ethynyl-2′-deoxyuridine (EdU) farging brukes til å visualisere DNA-replikasjon for å utelukke eventuelle S-faseceller. Denne protokollen gir en alternativ tilnærming til de konvensjonelle, ikke-denaturerende 5-brom-2′-deoksyuridin-baserte analysene (BrdU) og er bedre egnet for påvisning av ssDNA-foci utenfor S-fasen.

Introduction

For å opprettholde livet, undersøker og reparerer celler kontinuerlig DNA for å opprettholde sin genomiske integritet. Celler kan akkumulere ulike typer DNA-skade på grunn av både endogene (f.eks. oksidasjon, alkylering, deaminering, replikasjonsfeil) og eksogene (f.eks. UV, ioniserende bestråling) kilder til DNA-stressorer. Unnlatelse av å reparere disse lesjonene resulterer i enten apoptose, cellesyklusstans eller aldring og kan føre til sykdommer¹. DNA-lesjoner kan behandles av en av følgende hoved-DNA-reparasjonsveier: DR (direkte reverseringsreparasjon), som hovedsakelig reparerer alkylerte baser²; BER (base excision repair), som retter seg mot ikke-voluminøse DNA-basefeil og enkeltstrengede DNA-brudd (SSB)³; NER (nukleotideksisjonsreparasjon) korrigerer store, helixforvrengende DNA-lesjoner⁴; MMR (mismatch repair) hovedsakelig rettet mot DNA-uoverensstemmelser, innsettings-/slettingssløyfer (IDL) og visse baseskader⁵; NHEJ (ikke-homolog endesammenføyning) og HRR (homolog rekombinasjonsreparasjon) som begge er aktive ved dobbeltstrengede DNA-brudd (DSB)⁶; og TLS (translesjonssyntese), som er en bypassmekanisme for DNA-lesjon⁷. Selv om disse veiene har forskjellige substratspesifisiteter, er det visse overlappinger blant dem for å sikre redundans for effektiv reparasjon. Å forstå virkningen av de forskjellige DNA-reparasjonsveiene i forskjellige cellesyklusfaser er avgjørende, da disse DNA-reparasjonsfaktorene kan tjene som viktige mål for terapeutiske tilnærminger for å behandle kreft, aldring og nevrologiske lidelser ^8,9.

Enkeltstrenget DNA (ssDNA) genereres gjennom hele cellesyklusen på grunn av reparasjon av DNA-lesjoner generert av både endogene og eksogene DNA-skadelige midler. Ved genotoksisk stress genereres ssDNA rikelig i S- og G2-fasene hvor HRR og MMR har sin høyeste aktivitet, og når replikasjonsmaskineriet stopper opp eller kollapser når det møter DNA-lesjoner ^6,10,11. Andre DNA-reparasjonsveier (f.eks. NHEJ/mikrohomologi-mediert endesammenføyning (MMEJ)/enkeltstrenget glødning [SSA]) genererer også ssDNA under DSB-reparasjon¹². Disse ssDNA-sporene oppstår vanligvis fra DNA-reseksjon, utført av eksonukleaser som EXO1, DNA2 og CtIP under HR og MMR, endonukleaser som XPF og XPG under NER, eller gjennom den kombinerte virkningen av POLB og FEN1 under BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . På grunn av replikasjonsmaskineriets arbeid genereres også ssDNA-spor når DNA-helikasene slapper av DNA foran de PCNA-bundne replikerende polymerasene²⁰. I kontrast, i G1-fasen, reduserer mangelen på HRR og DNA-replikasjon og den begrensede aktiviteten til MMR omfanget av ssDNA-spor generert og er derfor mer utfordrende å oppdage 10,11,21.

Cellulære ssDNA-spor er svært følsomme strukturer som må beskyttes for å unngå dannelse av DSB. Dette oppnås ved å belegge ssDNA-sporene med RPA. RPA er et rikelig heterotrimerisk proteinkompleks sammensatt av flere underenheter (RPA1, RPA2 og RPA3, også referert til som henholdsvis RPA70, RPA32 og RPA14), som er allestedsnærværende uttrykt gjennom cellesyklus²². Hver RPA-underenhet inneholder et DNA-bindende domene (DBD), som er i stand til å interagere med 4-6 nukleotider, og de kombinerte underenhetene danner en stabil trimeriseringskjerne. Til sammen binder RPA til ca. 20-30 nukleotider med sub-nanomolar affinitet^23,24.

Konvensjonelle metoder bruker immunfluorescens (IF) mikroskopi for å visualisere ssDNA-foci ved å merke 5-brom-2′-deoksyuridin (BrdU) inkorporert i genomisk DNA ved bruk av BrdU-antistoffer²⁵. Denne tilnærmingen er avhengig av det faktum at BrdU-antistoffer bare kan oppdage BrdU i eksponert ssDNA²⁵. Selv om denne tilnærmingen er grei, viser den også visse begrensninger. For eksempel blir celler forbehandlet for å innlemme BrdU før starten av forsøket, noe som er tidkrevende og kan forstyrre nedstrøms effektorer. Derfor er BrdU-basert ssDNA-deteksjon begrenset til replikerende celler og kan ikke brukes til hvileceller. Dette utelukker anvendelsen av denne metoden for å studere DNA-reparasjon i ikke-replikerende celler til tross for dens betydning i flere sykdommer som kreft og nevrodegenerasjon ^5,26. I tillegg, fordi strukturene til BrdU og EdU er svært like, viser de fleste BrdU-antistoffer kryssreaktivitet mot EdU, som må vurderes når man sikter mot dobbeltmerkingseksperimenter²⁷. RPA-farging har tidligere blitt brukt til å vise ssDNA-foci hovedsakelig i S-faseceller; Noen papirer har imidlertid også med hell brukt det utenfor S-fasen 28,29,30,31,32,33,34,35. Følgende protokoll utnytter effektivt egenskapene til RPA, noe som tillater visualisering av ssDNA-foci etter DNA-skade i G1-fasen av cellesyklusen (selv om den kan brukes i alle cellesyklusfaser).

Protocol

1. Vedlikehold av hTERT-immortaliserte retinale pigmentepitelceller (RPE1) Opprettholde RPE1-cellelinjer i Dulbeccos modifiserte ørnemedium (DMEM) supplert med 10% varmeinaktivert føtal bovint serum (Hi-FBS) og 100 μg / ml penicillin-streptomycin (referert til som dyrkingsmedium fra nå av) i en fuktet inkubator med 5% CO2 ved 37 ° C. For rutinemessig dyrking, vokse RPE1-celler i en 15 cm vevskulturbehandlet tallerken og splitt når du når 80-90% sammenløp (~ 16-18 × 106 celler per 15 cm tallerken). Ved splitting, fjern mediet og skyll cellene med 10 ml 1x fosfatbufret saltvann (PBS). Tilsett 3 ml 0,05% Trypsin-EDTA for å dekke hele overflaten av parabolen. Hold cellene på 37 °C med trypsinet til de løsner. Etter trypsinisering, resuspender cellene med dyrkingsmedium og spinn dem ned ved 150 × g i 5 minutter ved romtemperatur (RT, 22-25 ° C). Fjern supernatanten og resuspender cellene forsiktig i 10 ml dyrkingsmedium. Frø 1,6-1,8 × 106 celler til en ny 15 cm tallerken (~1 ml av cellesuspensjonen).MERK: Alt vevskulturarbeid skal gjøres under BSL-2 sikkerhetsnivåer. Inkubasjonstiden for trypsinisering avhenger av cellekonfluens. Vanligvis tar prosessen 2-3 minutter å fullføre for en 90% konfluerende plate. Celler bør undersøkes for Mycoplasma-forurensning regelmessig med kommersielt tilgjengelige sett (se eksempler i materialfortegnelsen). 2. siRNA slår ned genet av interesse (GOI) Frø 1,0 × 106 RPE1-celler til en 10 cm vevskulturbehandlet plate med 10 ml dyrkingsmedium dagen før transfeksjonen. På dagen for transfeksjonen, kompleks siRNA. For en 10 cm plate, bruk en endelig konsentrasjon på 20 nM siRPA2 og 12 μL lipidbasert transfeksjonsreagens i 500 μL lavserumtransfeksjonsmedium. Bland forsiktig alle komponentene ved å knipse på røret og rug ved RT (22-25 °C) i 5 minutter. Tilsett den komplekse siRNA-blandingen til cellene dråpevis og inkuber cellene med siRNA i 48 timer. 3. Synkronisering av RPE1-celler i G0-fase Trypsiniser RPE1-cellene fra trinn 2.3 som beskrevet i avsnitt 1 (~2 × 106 celler). Overfør cellesuspensjonen til 15 ml sentrifugerør og sentrifuger den ved 150 × g, RT (22-25 °C) i 5 minutter. Fjern supernatanten og resuspender cellene i 12 ml PBS. Sentrifuger cellene ved 150 × g ved RT (22-25 °C) i 5 minutter. Gjenta fjerningen av supernatanten og sentrifugeringen to ganger. Resuspender cellene i 10 ml serumfritt DMEM supplert med 100 μg / ml penicillin-streptomycin,  1 mM natriumpyruvat, 15 mM HEPES, og plate dem på en 10 cm vevskulturskål.MERK: Hvis cellene har en tendens til å klumpe seg, resuspender dem i bare 1 ml serumfri DMEM og pipetter dem opp og ned 5x ved hjelp av en P1000-spiss for å løsne klumpene før du fortynner suspensjonen opp til et endelig volum på 10 ml. Etter 24 timer med serumsult, introduser den andre runden med silencing ved å bruke samme prosedyre som beskrevet i avsnitt 2 ved å tilsette det komplekse siRNA til de serumsultende cellene. Hold RPE1-cellene i serumfri DMEM i 72 timer før du fortsetter til G1-utgivelse. 4. Coverslip belegg og slippe celler i G1 fase Steriliser pinsett med 70% etanol og plasser et enkelt glassdeksel (12 mm i diameter og # 1,5 tykkelse [0,17 mm]) i en brønn med en 24-brønnsplate. Fortynn matrisen av vitronektinbelegget med PBS for å oppnå en endelig konsentrasjon på 10 μg / ml. Tilsett 500 μL av vitronectinoppløsningen i hver brønn som inneholder dekselene og inkuber i 1 time ved RT. Fjern beleggoppløsningen og vask dekslene med 1 ml PBS. Løsne de serumsultne RPE1-cellene fra den 10 cm vevsdyrkede behandlede platen med 1 ml 0,05 % trypsin etter en PBS-vask i 1 min ved 37 °C.MERK: Celler løsner mye raskere etter serumsult. Vær forsiktig når du vasker cellene med PBS og bruk korte trypsiniseringstider. For å inaktivere trypsinet, resuspender RPE1-cellene i totalt 6 ml dyrkingsmedium. Fjern det inaktiverte trypsinet ved å spinne ned cellene med 150 × g ved RT (22-25 °C) i 5 minutter. Resuspender cellene i 1 ml dyrkingsmedium og mål cellenummeret. Frø 4 × 104 RPE1-celler på den belagte dekselet i totalt 500 μL dyrkingsmedium.MERK: Forsikre deg om at cellens levedyktighet er over 90% før du fortsetter til nedstrømstrinn. Cellens levedyktighet kunne raskt vurderes ved trypanblå farging under celletellingstrinnet. Etter 6 timer med plating av cellene i kulturmediet, vil G0-frigjorte celler være i tidlig G1-fase. Utfør eksperimenter i G1 i dette 6-12 timers vinduet før cellene begynner å gå inn i S-fasen. Før du introduserer DNA-skade, pulser cellene med 10 μM 5-etynyl-2′-deoksyuridin (EdU) i 30 minutter ved 37 °C, fortynnet i dyrkningsmedium. Fjern mediet som inneholder EdU og jag cellene med 10 μM tymidin i 10 minutter ved 37 °C for å forhindre gjenværende EdU-inkorporering under induksjon av DNA-skade. Fjern mediet med tymidin og behandle cellene med 250 μMH2O2i 1 time, fortynnet i dyrkningsmedium. 5. Immunfluorescensfarging av ssDNA Vask cellene én gang med 1 ml RT (22-25 °C) PBS for å fjerne medium- og serumkomponentene.NOTAT: Vær forsiktig når du vasker cellene for å unngå løsrivelse og tørking. Ikke behandle mange brønner samtidig. Preekstraksjon: Inkuber de vaskede cellene i 1 ml CSK ekstraksjonsbuffer (tabell 1) i 5 minutter ved RT (22-25 °C).MERK: CSK-preekstraksjon fjerner alle ikke-kromatinbundne proteiner, inkludert løselig RPA2.FORSIKTIG: Triton X-100 er skadelig ved svelging og kan forårsake hudirritasjon og øyeskader. Fjern CSK-bufferen fra cellene og fikser dem direkte ved å tilsette 0,5 ml 3,6% paraformaldehydoppløsning (i PBS) inneholdende 0,05% Triton X-100 i 10 minutter ved RT (22-25 °C).FORSIKTIG: Det er viktig å tilberede 3,6% PFA fra 32% PFA-lager ferskt. Paraformaldehyd kan forårsake alvorlig øyeskade, hudirritasjon og luftveisirritasjon. Vask cellene en gang med 1 ml PBS inneholdende 0,05% Triton X-100 for å fjerne PFA. Videre permeabiliserer celler ved bruk av 1 ml PBS inneholdende 0,5% Triton X-100 i 15 minutter ved RT (22-25 °C). EdU click-IT-reaksjon for å visualisere replikerende celler (S-fase)Fjern permeabiliseringsoppløsningen og vask cellene 2x med 1 ml blokkeringsbuffer (tabell 1).FORSIKTIG: Bovint serumalbumin (BSA) kan forårsake irritasjon i luftveiene. Tilsett 1 ml blokkeringsbuffer (tabell 1) og gyng forsiktig den dekkslipholdige platen i 10 minutter ved RT (22-25 °C). Fjern blokkeringsbufferen og tilsett 500 μL klikkreaksjonscocktail inneholdende pikolylazid 647 (tabell 1). Inkuber dekslene i 30 minutter ved RT (22-25 °C) ved hjelp av forsiktig gynging og utfør nedstrøms inkubasjoner i mørket.MERK: Når du bruker BrdU-antistoffer, bruk dobbelt så mye (1 ml) og tid (60 min) for klikkreaksjonen som anbefalt av produsenten for å sikre at reaksjonen er mettet og den inkorporerte EdU er merket. Dette begrenser kryssreaktiviteten til BrdU-antistoffene27. Fjern klikkreaksjonsblandingen og vask cellene 2x med PBS med 0,05 % Triton X-100 i 10 minutter ved RT (22-25 °C) (figur 1 og figur 2). Tilsett 1 ml blokkeringsbuffer og inkuber ved RT (22-25 °C) i 30 minutter. Alternativt kan du holde cellene i blokkbuffer ved 4 °C over natten. Påfør primært antistoff (anti-RPA2-rotte, 1:1,000 fortynning) i 2 timer ved RT (22-25 °C) i 250-500 μL blokkerende buffer med forsiktig gynging. Vask cellene 2x med PBS inneholdende 0,05% Triton X-100 for raskt å fjerne det meste av antistoffoppløsningen. Fortsett å vaske cellene i 3 x 10 min med blokkeringsbuffer ved RT (22-25 °C). Påfør sekundært antistoff (anti-rotte Alexa-488, 1: 1,000 fortynning) i 250-500 μL blokkeringsbuffer ved RT (22-25 ° C) i 2 timer med forsiktig rocking. Vask cellene med blokkerende buffer 2x for raskt å fjerne det meste av det sekundære antistoffet. Fortsett å vaske cellene i 3 x 10 min med PBS inneholdende 0,05% Triton X-100 ved RT (22-25 °C). For å motvirke kjernene, vask celler en gang med PBS som inneholder 0,05% Triton X-100 og 1 μg / ml 4 ‘,6-diamidino-2-fenylindol (DAPI) i 10 minutter ved RT (22-25 ° C). Vask cellene én gang med PBS i 5 minutter ved RT (22-25 °C). Monter dekselglasset på mikroskoplysbilder med 10 μL monteringsmedium / deksel. Dypp dekslene i destillert vann før montering for å bli kvitt eventuelle saltkrystaller. Ta bilde av lysbildene neste dag og oppbevar dem ved 4 °C i flere uker (figur 3). 6. Bildeinnsamling og kvantifisering For å ta bilder, bruk et hvilket som helst tilgjengelig epifluorescerende mikroskop utstyrt med rutinemessige filtersett for å avbilde DAPI-, FITC- og Cy5-kanaler med minst 60-63x forstørrelse, høy numerisk blenderåpning og oljemål for å visualisere kjernefysiske foci.MERK: Optimal DAPI-eksitasjon er ~ 359 nm; Alexa 488 eksitasjon er ~ 488 nm; mens Alexa 647-eksitasjon er ~ 647 nm. For bildeanalyse, åpne bildefiler i Fiji / ImageJ.Lag kjernefysiske masker ved hjelp av DAPI-fargingen (figur 4A-F og tilleggsvideo S1).Åpne DAPI-bildet. Velg prosess | Forbedre kontrasten og angi mettet bildepunkt til 0,35. Klikk på Prosess | Binær | Konverter til maske. Velg binær | Fyll hull og klikk på Analyser | Analyser partikler. Sett størrelsen til 10-Infinity. I ROI manager klikker du på Vis alle. Finne RPA2-foci i kjernen (figur 4G,H og tilleggsvideo S1)Åpne RPA2-bildet. Velg Prosess | Finn Maxima. Angi prominensen til en verdi som uthever RPA2-foci (mellom 500 og 750), og skille den fra bakgrunnen. Til slutt klikker du på Mål-knappen i ROI Manager. Beregn totalt antall nukleære ssDNA-foci ved å dele verdien i Rawinden-kolonnen med 255 (maksimal verdi av pikselintensitet i hver foci). Utfør statistisk analyse ved hjelp av det foretrukne statistiske programvareverktøyet.MERK: Utelat alle EdU-positive celler og feilaktig segmenterte DAPI-masker fra analysen.

Representative Results

For å overvinne begrensningene ved å oppdage ssDNA i G1, brukte vi RPA2, som forbedrer både spesifisiteten og intensiteten av ssDNA-foci-deteksjon35. For å oppnå presis cellesynkronisering brukte vi RPE1-celler som effektivt kan serum-sultne og synkroniseres til G0-fase. De kan deretter induseres til å gå inn i cellesyklusen igjen ved tilsetning av serum etter serummangel. For å bekrefte synkroniseringseffektiviteten merket vi cellene med EdU og deres DNA-innhold med propidiumjodid. Videre samlet vi inn kvalitative og kvantitative resultater via flowcytometri (tilleggsfigur S1A). Prikkplottene viser at etter 72 timer med serumsult er ~98% av cellene i G0-fase. Etter tilsetning av serumholdige medier i 6 timer, går cellene inn i cellesyklusen (som vist ved økningen i p27-nivåer i figur 1A), med ~ 97% av cellene i G1, mens de bare har <1% celler i S-fase, <2% celler i G2-fase (tilleggsfigur S1A). Etter 20-28 timer med tilsetning av serum til cellene, passerer de gradvis gjennom S-fase, som vist ved flowcytometriplottene (tilleggsfigur S1A). Denne cellesynkroniseringsprotokollen gir en ~ 97% ren G1-populasjon (6 timer etter serumtillegg etter 72 timer serumsult). For ytterligere å validere synkroniseringseffektiviteten sammenlignet vi uttrykket av cellesyklusmarkører etter serumfrigjøring ved hjelp av vestlig blotting (figur 1A og tilleggsfigur S1B) og parallelt utførte vi en EdU-inkorporeringsanalyse for å visualisere DNA-replikasjon. EdU-fargingen fremhever også synkroniseringseffektivitet og mangel på DNA-replikasjon i G1-fase (figur 1B,C). Konvensjonelle metoder for å oppdage ssDNA i pattedyrceller er avhengige av påvisning av BrdU i ssDNA. Figur 2A viser at vedH2O2- og neokarzinostatinbehandling (NCS) var BrdU-foci bare detekterbare i S-faseceller, mens ingen ssDNA-foci kunne påvises i ikke-S-faseceller. BrdU-antistofffargingen viste også en merkbar nukleolær bakgrunnsfarging som kunne påvises i alle kjernene, uavhengig av cellesyklusstadiet eller behandlinger som ble brukt. Ved å bruke EdU-klikkprotokollen som er beskrevet her, kunne vi ikke oppdage samlokalisering av EdU- og BrdU-foci, noe som er tydelig i de ubehandlede prøvene i figur 2A. For helt å utelukke ethvert BrdU-signal som oppsto fra kryssreaktivitet, unngikk vi EdU-merking og brukte heller cyklin A2 som en S-G2-markør. Syklin A2-farging tillot imidlertid ikke CSK-preekstraksjon, og under denne tilstanden så vi ingen BrdU-foci, selv etter genotoksisk stress (tilleggsfigur S2A). Dette fremhever det faktum at CSK pre-ekstraksjon er nødvendig for anti-BrdU-basert ssDNA-farging. Som en kontroll testet vi BrdU-antistofffarging under denaturerende forhold. Dette åpner DNA for å avsløre den innlemmede BrdU, som avslører at BrdU var jevnt innlemmet (tilleggsfigur S2B). I motsetning til dette viser RPA2-farging NCS- ogH2O2-avhengigfocidannelse ikke bare i S-fasen, men også i andre cellesyklusfaser (figur 2B). Som en kontroll behandlet vi også cellene med HU, som bare forårsaker ssDNA-akkumulering i celler som gjennomgår replikasjon. Som forventet oppdaget vi bare en signaløkning ved HU-behandling med RPA2-antistoffet i EdU-positive celler, noe som fremhever spesifisiteten til denne tilnærmingen. RPA2-antistoffet kan også påvise naturlig forekommende ssDNA-dannelse under replikasjon i fravær av eksogent genotoksisk stress (figur 2B). Den svært følsomme naturen til RPA2-antistoffet fikk oss til å prøve å utnytte det i G1-fasen der konvensjonell BrdU-farging ikke klarte å oppdage noe signal ved genotoksisk stress (tilleggsfigur S2C). Figur 3A viser at dannelse av ssDNA-foci vedH2O2-behandlingvar påviselig ved bruk av et anti-RPA2-antistoff, selv i G1. Det var en signifikant økning i antall RPA2-foci i disse kjernene vedH2O2-behandling(figur 3B). Disse fociene var spesifikke for RPA2 da deaktivering av RPA2 avskaffet IF-signalet (figur 3A,B). Figur 3C og tilleggsfigur S1C viser effektiviteten av RPA2-aktivering i disse cellene. Sammenlignet med konvensjonelle metoder er RPA2-basert deteksjon av ssDNA svært sensitiv, og anvendelsen kan derfor utvides til G1-faseceller. Figur 1: Synkroniseringseffektivitet av RPE1-celler etter serumsult. (A) Immunoblotter viser indikerte proteinnivåer i asynkrone, G1- og S-fasesynkroniserte RPE1-celler. (B) Representative bilder viser asynkrone, G1- og S-fasesynkroniserte RPE1-celler som ble utsatt for 10 μM EdU i 30 minutter før fiksering og visualisert ved Click-IT-reaksjon. DAPI ble brukt til å motvirke kjernefysisk DNA. Skala barer = 50 μm. (C) Graf viser prosentandel av EdU-positive celler over den totale cellepopulasjonen vurdert av DAPI. Feillinjen representerer standardfeil av gjennomsnitt, og det analyserte antall kjerner var følgende: AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Forkortelser: RPE1 = hTERT-immortaliserte retinale pigmentepitelceller; AS = asynkron; EdU = 5-etynyl-2′-deoksyuridin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 2: ssDNA-påvisning med enten BrdU-antistoff eller RPA2-antistoff ved DNA-skade. (A) Representative bilder illustrerer ssDNA-foci ved hjelp av αBrdU (grønn), S-faseceller er uthevet av EdU (lilla), og DAPI ble brukt til å motvirke nukleært DNA (blått). RPE1-celler ble holdt i 10 μM BrdU i 48 timer før ytterligere behandling. Etter 48 timer ble cellene pulsert med 10 μM EdU i 30 minutter etterfulgt av behandling av H2O2 (250 μM) i 1 time eller Neocarzinostatin (0,5 μg / ml) i 4 timer. Celler ble fiksert etter CSK pre-ekstraksjon. En hvit stiplet linje angir grensen til hver kjerne. Skala bar = 5 μm. Paneler til høyre er forstørrede bilder av de angitte S-fase- eller ikke-S-fasekjernene. (B) Representative bilder illustrerer ssDNA-foci ved bruk av αRPA2-antistoff (grønn). S-faseceller er uthevet av EdU (lilla), og DAPI ble brukt til å motvirke nukleært DNA (blått). RPE1-celler ble pulsert med 10 μM EdU i 30 minutter etterfulgt av enten 1 hH 2O2 (250 μM), 4 timer hydroksyurea (2 mM) eller 4 timer NCS (0,5 μg / ml). Celler ble fiksert etter CSK pre-ekstraksjon. En hvit stiplet linje angir grensen til hver kjerne. Skala bar = 10 μm. Paneler til høyre er forstørrede bilder av de angitte S-fase- eller ikke-S-fasekjernene. Forkortelser: ssDNA = enkeltstrenget DNA; BrdU = 5-brom-2′-deoksyuridin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; RPE1 = hTERT-immortaliserte retinale pigmentepitelceller; EdU = 5-etynyl-2′-deoksyuridin; NCS = Neocarzinostatin; HU = hydroksyurea. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 3: Påvisning av ssDNA-foci i G1-fase ved bruk av RPA2-antistoff. (A) RPE1-celler ble transfeksjonert med enten siRNA rettet mot RPA2 eller en ikke-målrettende siRNA-kontroll, og deretter synkronisert i G1 og pulsmerket med 10 μM EdU i 30 minutter før de ble behandlet med H2O2 (250 μM) i 1 time der det var indikert. DAPI ble brukt til å motvirke kjernefysisk DNA. Celler ble fiksert etter CSK pre-ekstraksjon. En hvit stiplet linje angir grensen til hver kjerne. Skala bar = 5 μm. (B) Målingene for antall RPA2 foci / kjernen ble utført fra to uavhengige eksperimenter. Kun EdU-negative celler ble vurdert under analysen. Linjer representerer middelverdien på plottene. Ikke-parametrisk ANOVA-test (Kruskal-Wallis) ble utført for statistisk analyse. Stjernene indikerer P < 0,0001. Det analyserte antall kjerner var følgende: siNT no H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) Effektiviteten av siRNA-knockdown er vist i immunoblotting. Forkortelser: siNT = ikke-målrettende siRNA-kontroll; BrdU = 5-brom-2′-deoksyuridin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; RPE1 = hTERT-immortaliserte retinale pigmentepitelceller; EdU = 5-etynyl-2′-deoksyuridin. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Figur 4: Kvantifisering av ssDNA-foci ved bruk av Fiji. Detaljerte trinn i Fiji som viser hvordan du vurderer RPA2-foci-tall i kjernen. (A-E) Opprettelsen av en atommaske ved hjelp av DAPI-kanalen. (VG Nett) Terskel for å identifisere individuelle nukleære ssDNA-foci fra bakgrunnssignalet. Forkortelser: ssDNA = enkeltstrenget DNA; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Cytoskeletal (CSK) buffer RØR pH 7,0 10 mM NaCl 100 mM EDTA pH 8 1 mM MgCl2  3 mM D-sukrose 300 mM Triton X-100 0.20% Fosfatasehemmere cocktail 1 tablett per 10 ml Proteaseinhibitor cocktail 1 tablett per 10 ml fortynnet i ddH2O N/a Vaske buffer Triton X-100 0.05% fortynnet i PBS N/a Permeabilisering buffer Triton X-100 0.50% fortynnet i PBS N/a Fiksering løsning Paraformaldehyd 3.60% Triton X-100 0.05% fortynnet i PBS N/a Blokkering av buffer Bovint serumalbumin (BSA) 5% Triton X-100 0.10% fortynnet i PBS N/a Klikk-iT Plus reaksjonscocktail 1x Click-iT reaksjonsbuffer 435 ml Alexa Fluor PCA-løsning 5 ml CuSO4-kobber protectant premix 10 ml 1x Click-iT bufferadditiv 50 ml Totalt volum 500 ml Tabell 1: Sammensetning av bufferne som brukes i denne protokollen. Tilleggsfigur S1. (A) RPE1-celler ble synkronisert til G0-fase ved bruk av serumsult i 72 timer og deretter frigjort til forskjellige cellesyklusfaser ved å gjeninnføre serum. Prikkplott viser celler i G0/G1-, S- eller G2/M-faser, hvor timer angir tiden etter ny tilsetning av serum etter serumsult. Grafen til høyre viser prosentandelen av G0/G1-, S- og G2/M-celler i hver tilstand. FACS-analyse ble utført ved hjelp av et kommersielt tilgjengelig celleproliferasjonssett ved bruk av EdU og propidiumjodid i henhold til produsentens anbefalinger. (B) Ubeskårne western blot-skanninger for figur 1. Tall viser molekylvektmarkører i kDa. PARP1 ble brukt som lastekontroll og lastet på gelen som også ble utviklet mot CCNA2, p27 (videre strippet for PCNA) og pH3 (S10) (ytterligere strippet for H3) ved å kutte opp membranen. CCNB1 og RPA2 ble lastet på en separat gel ved bruk av samme mengde proteinlysat for å sikre sammenlignbarhet. (C) Ubeskårne western blot-skanninger for figur 3. Tall viser molekylvektmarkører i kDa. Forkortelse: EdU = 5-etynyl-2′-deoksyuridin. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsfigur S2: (A) Representative bilder illustrerer ssDNA-foci ved bruk av BrdU-antistoff (grønn); S-faseceller er uthevet av syklin A2 (rød); og DAPI ble brukt til å motvirke nukleært DNA (blått). RPE1-celler ble holdt i 10 μM BrdU i 48 timer før videre behandling. Etter 48 timer ble cellene behandlet medH2O2(250 μM) i 1 time eller neokarzinostatin (0,5 μg/ml) i 4 timer før fiksering. En hvit stiplet linje angir grensen til hver kjerne. Skala bar = 5 μm. (B) BrdU farging av RPE1 celler med og uten denaturering tilstand. Asynkrone RPE1-celler ble forhåndsbehandlet med 10 μM BrdU i 48 timer. Skala bar = 10 μm. (C) Målingene for antall BrdU foci / kjerne ble utført fra to uavhengige eksperimenter i G1 synkroniserte RPE1 celler. Kun EdU-negative celler ble vurdert under analysen. Linjer representerer middelverdien på plottene. Ikke-parametrisk ANOVA-test (Kruskal-Wallis) ble utført for statistisk analyse. ‘ns’ indikerer ikke-signifikant forskjell. Det analyserte antall kjerner var følgende: NT n = 52, NCS n = 105, H2O2 n = 82. Forkortelser: siNT = ikke-målrettende siRNA-kontroll; BrdU = 5-brom-2′-deoksyuridin; DAPI = 4′,6-diamidino-2-fenylindol; RPE1 = hTERT-immortaliserte retinale pigmentepitelceller; NCS = Neocarzinostatin. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggsvideo S1: Skjermopptak av Fiji-basert RPA2-focianalyse. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Opprettholde en sunn, mykoplasmafri cellekultur er kritisk for alle forsøkene beskrevet ovenfor. RPE1-celler har et sterkt vedlegg til vevskulturbehandlet plastvare under normale dyrkingsmedier; Imidlertid reduseres bindingsegenskapene betydelig når de oppbevares i serumfrie forhold. I tillegg, for å fange høyoppløselige bilder av ssDNA-foci under et mikroskop, må cellene belegges på et 0, 17 mm tykt dekselglass, som ikke er hydrofilt nok til å støtte riktig vedlegg av RPE1-celler. Uten riktig flate og jevnt fordelte celler er det svært utfordrende å visualisere individuelle ssDNA-foci. Derfor er det viktig å velge riktig beleggmateriale (f.eks. Vitronectin) og å gi tilstrekkelig tid (6-12 timer) for cellene å spre seg og feste etter å ha sluppet dem ut i G1-fasen.

En utfordrende del av protokollen er å oppnå homogene G1-synkroniserte RPE1-celler. Dette krever to kritiske trinn. For det første, for effektiv serumsult, må cellene trypsiniseres, vaskes grundig med PBS og sås direkte på nye vevskulturretter ved bruk av serumfrie medier. Vasking av cellene direkte i vevskulturretter for å fjerne serumet vil ikke gi effektiv G0-synkronisering. For det andre, når man frigjør celler i G1-fase, må cellene trypsiniseres igjen og frøes på friske vevskulturplater. På samme måte vil bare endring av mediet og tilsetning av serumholdig dyrkingsmedium til cellene ikke resultere i en synkron G1-oppføring. I tillegg, for riktig G1-oppføring, må såtettheten til cellene på de belagte dekselbrillene være på visse konfluensnivåer. Mens perfekt cellesynkronisering generelt ikke er oppnåelig, gir denne synkroniseringsprotokollen beskrevet her en ~ 97% ren G1-populasjon. Den anbefalte såtettheten for RPE1 på en 12 mm diameter dekkslipp er ~ 4 × 10⁴ for å oppnå et homogent synsfelt for avbildning, med omtrent 70% konfluens. Høyere såtetthet fører til at celler løsner og “flasser av” etter CSK-ekstraksjon og vil resultere i et høyere bakgrunnssignal under bildeopptak.

For å redusere bakgrunnssignaler og oppnå et gunstig signal-støy-forhold, er grundig vask etter primær og sekundær antistoffinkubasjon avgjørende. Siden mange vasketrinn skal brukes, er det også viktig å forhindre at brønnen tørker ut under hvert vasketrinn. Vi minimerer denne artefakten ved å bruke minimum 0,05% Triton X-100 i alle vaske- og inkubasjonstrinnene. Når brønnene tørket ut, viste cellene et endret signal-støy-forhold; Dette fører til et mosaikklignende mønster under mikroskopet og kan forstyrre evalueringen. Z-stack bildeopptak kombinert med dekonvolusjon kan hjelpe til med å fange foci i forskjellige fokalplan for å forbedre analysen.

Konvensjonelle metoder er avhengige av deteksjon av innlemmet BrdU under ikke-denaturerende forhold. Disse metodene avhenger imidlertid av forbehandling av cellene med høye doser av BrdU i minst 1-2 dager (eller tid tilsvarende en full cellesyklus i cellelinjen som brukes) for å sikre jevn genomisk inkorporering. Uønsket kan omfattende BrdU-inkorporering forårsake cellesyklusinterferens³⁶. For å løse disse begrensningene bruker denne metoden endogen RPA2 for å oppdage ssDNA-foci. Denne tilnærmingen krever ikke replikasjonsdrevet BrdU-inkorporering, den kan også brukes i postmitotiske celler. Siden omfattende BrdU-innlemmelse ikke er nødvendig, sparer dette tid og reduserer eksperimentell kompleksitet. Ved å bruke RPA2-farging for å visualisere ssDNA, kan vi bruke 2′-deoksy-5-etynyluridin (EdU) og klikk-kjemi for å markere DNA-replikasjon samtidig som vi unngår mulig kryssreaktivitet av BrdU-antistoffene mot EdU 27,37,38. Spesiell forsiktighet må utvises for å maskere den inkorporerte EdU riktig under klikkreaksjonen, slik at BrdU-antistoffene ikke vil kryssreagere med EdU^27,39.

Til slutt er en viktig fordel ved å bruke RPA2 i stedet for BrdU ganske enkelt å ha et overlegent signal-til-støy-forhold sammenlignet med BrdU-farging utenfor S-fasen. Vi fant at den ikke-denaturerende BrdU-fargingen og dens evne til å visualisere ssDNA er begrenset til S-fase selv i replikerende celler (figur 2). BrdU-antistoff binder seg bare til den tilstrekkelig eksponerte BrdU i ssDNA-strekk. Bindingen av reparasjonsproteiner, inkludert RPA2, til ssDNA-strekkene kan undertrykke eller hemme tilstrekkelig eksponering av BrdU i ssDNA. Vi fant også at CSK pre-ekstraksjon er nødvendig for ssDNA visualisering ved bruk av BrdU antistoff. Dette er mulig fordi ssDNA-sporene ikke er tilgjengelige for antistoffet uten å fjerne lett bundne proteinkomponenter fra dem.

Likevel er det noen begrensninger knyttet til denne protokollen. En begrensning ved bruk av RPA2 for ssDNA-deteksjon er behovet for å optimalisere CSK-pre-ekstraksjonstrinnet. Ubundet, overflødig RPA2 må vaskes bort fra DNA før de fikser cellene. På den ene siden fører underekstraksjon til en høy bakgrunn på grunn av RPA2-proteinfraksjonen som ikke er bundet til ssDNA. På den annen side vil overekstraksjon føre til signaltap. For BrdU-deteksjon er dette ikke en variabel siden BrdU er stabilt innlemmet i DNA og ikke kan vaskes bort ved pre-ekstraksjon. Derfor må tidspunktet for CSK-preekstraksjonen, mengden Triton X-100 i bufferen, volumet og temperaturen der preekstraksjonen utføres, vurderes nøye. CSK-preekstraksjon begrenser også bruken av kjernestørrelse for å diskriminere G0/G1-celler fra S/G2-celler.

I tillegg kan vi ikke utelukke muligheten for at noe av signalet som kommer fra RPA2 stammer fra at det er bundet til andre kromatinbindende proteininteraktorer. Man må også vurdere artsspesifisiteten til RPA2-antistoffet. Antistoffet som brukes i denne protokollen kan gjenkjenne menneske, mus, rotte, hamster og ape RPA2. En annen begrensning av denne tilnærmingen er at ikke alle cellelinjer kan serum-sultet for G0-synkronisering. De fleste kreftcellelinjer kan omgå cellesykluskontrollpunkter og spre seg selv i serumberøvede medier. Selv om serum sult er gunstig, siden det ikke forårsaker DNA-skade, må man nøye overvåke deres cellesynkroniseringseffektivitet for å sikre at riktig cellesyklusfaseanrikning oppnås. For celler som ikke responderer på serumdeprivasjon, må andre cellesynkroniseringsmetoder vurderes (f.eks. mitotisk shake off, CDK1-hemming for G2-arrest eller ikke-invasive teknikker som sentrifugal eluriasjon). En annen mulig metode er å bruke bildebehandling med høyt innhold for å måle EdU og nukleært DNA-innhold for cellesyklusprofilering av asynkrone celler³¹. Man må vurdere implikasjonene ved å bruke alternative synkroniseringsmetoder for å forhindre interferens med nedstrømsanalyse. For eksempel vil bruk av dobbel tymidinblokk eller aphidikolin, ofte brukt i litteraturen, resultere i replikasjonsstress og DNA-skade⁴⁰.

Undersøkelsen av DNA-reparasjonsmekanismer fortsetter å være et fokuspunkt for diskusjon innen kreft og cellebiologi. Protokollen som presenteres her gir en verdifull tilnærming for fremstilling av celler, som muliggjør visualisering og kvantitativ analyse av ssDNA ved eksponering for DNA-skadelige midler. Spesielt fremhever denne protokollen bruken av ssDNA-bindingsproteinet, RPA2, og demonstrerer dets høye spesifisitet for å visualisere små mengder ssDNA-foci samtidig som man unngår uønsket kryssreaktivitet i alle cellesyklusfasene. Bruk av RPA2 gir mange fordeler, spesielt for forskere som tar sikte på å analysere celler i G1-fasen av cellesyklusen. Denne protokollen vurderer flere begrensninger og adresserer bekymringer knyttet til signalinterferens, uønsket bakgrunnsstøy og kryssreaktivitet når du bruker RPA2- eller BrdU-farging for å oppdage ssDNA.

Materials

Alpha-tubulin antibody	Sigma-Aldrich	T6074	primary antibody (1:5,000)
Axio Observer Inverted Microscope	Zeiss	na	microscope
Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12%	Invitrogen	NW04127BOX	Western Blot
Bovine Serum Albumin	Jackson ImmunoResearch	001-000-162	blocking
BrdU (5-Bromo-2'-deoxyuridine)	Sigma-Aldrich	B5002-100MG	nucleotide analogue
BrdU antibody BU1/75	Abcam	ab6326	primary antibody (1:500)
CellAdhere Dilution Buffer	Stemcell Technologies	07183	coating reagent
Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits	Invitrogen	C10632	flow cytomery
Click-iT Plus EdU Cell Proliferation Kit for Imaging, Alexa Fluor 647 dye	Thermo Fisher Scientific	C10640	click-reaction kit
cOmplete ULTRA Protease inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	5892791001	reagent
Countess 3 Automated cell counter	Thermo Scientific	AMQAX2000	cell counter
Coverslip	neuVitro	GG12PRE	tissue culture
Cyclin A2 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-271682	primary antibody (1:1,000) for IF and WB
Cyclin B1 antibody	Santa Cruz Biotechnology	sc-245	primary antibody (1:5,000)
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D2650-100ML	vehicle control
DMEM, high glucose, with HEPES	Gibco	12430051	cell culture medium for RPE cells
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144	the PBS used throughout the protocol
D-Sucrose	Thermo Fisher Scientific	bp220-1	reagent
Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope	Nikon	na	microscope
EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)	Thermo Fisher Scientific	C10637	nucleotide analog
Falcon 24-well plate	Corning	351147	tissue culture
Falcon Cell Culture Dishes 100 mm	Corning	353003	tissue culture
Fetal Bovine Serum, heat inactivated	Gibco	16140071	media supplement
Fiji (ImageJ)	NIH	version 1.54f	software and algorithms
FxCycle PI/RNase Staining Solution	Invitrogen	F10797	PI staining
Goat anti-mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 555	Thermo Fisher Scientific	A21422	secondary antibody (1:1,000)
Goat anti-rat IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor Plus 488	Thermo Fisher Scientific	A48262	secondary antibody (1:1,000)
Histone H3 antibody	Abcam	ab1791	primary antibody (1:10,000)
hTERT RPE1	ATCC	CRL-3216	cell line
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758-100ML	reagent
Hydrogen peroxide 30% soultion	Sigma-Aldrich	H1009-100ML	reagent
Hydroxyurea,98% powder	Sigma-Aldrich	H8627-5G	reagent
Invitrogen Ultra Pure 0.5 M EDTA pH 8.0	Thermo Fisher Scientific	15-575-020	reagent
Lipfectamine RNAiMAX Transfection Reagent	Invitrogen	13778150	transfection reagent
Magnesium chloride solution 1 M	Sigma-Aldrich	M1028-100ML	reagent
MycoFluor	Thermo Fisher	M7006	Mycoplasma Detection Kit
Neocarzinostatin from Streptomyces carzinostaticus	Sigma-Aldrich	N9162-100UG	reagent
NuPage MES SDS Running Buffer (20x)	Invitrogen	NP0002	Western Blot
onTARGETplus Human RPA2 siRNA	Dharmacon	L-017058-01-0005	siRNA
p27 antibody	BD Biosciences	610241	primary antibody (1:1,000)
Paraformaldehyde aqueous solution (32%)	Electron Microscopy Sciences	50-980-494	fixative
PARP1 antibody	Cell Signaling Technology	9542S	primary antibody (1:1,000)
PCNA antibody	Cell Signaling Technology	13110S	primary antibody (1:2,000)
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140163	media supplement
pH3 antibody	Cell Signaling Technology	3377S	primary antibody (1:2,000)
PhosSTOP phosphatase inhibitor tablets	Sigma-Aldrich	4906837001	reagent
PIPES Buffer 0.5 M solution, pH 7.0	Bioworld	41620034-1	reagent
Precision Plus Protein Kaleidoscope Prestained Protein Standards	Bio-Rad	1610395	Western Blot
Prism	GraphPad	version 10	statistical analysis and graph
ProLong Diamond Antifade Mountant	Thermo Scientific	P36961	mounting media
Reduced serum media (Opti-MEM)	Gibco	31985070	used for transfection
Rpa32/rpa2 antibody (mouse)	EMD Millipore	NA19L	primary antibody (1:1,000) for WB
Rpa32/rpa2 antibody (rat)	Cell Signaling Technology	2208S	primary antibody (1:1,000) for IF
Sodium Chloride solution (5 M)	Sigma-Aldrich	S5150	reagent
Sodium Pyruvate (100 mM)	Gibco	11360070	media supplement
Sodium tetraborate decahydrate	Sigma-Aldrich	B3535-500G	reagent
Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain	Thermo Scientific	62248	nucleic acid stain
Thymidine,powder	Sigma-Aldrich	T1985-1G	reagent
Triton X-100 aqueous solution (10%)	Sigma-Aldrich	11332481001	detergent
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red	Gibco	1540054	cell dissociation agent
Vitronectin XF	Stemcell Technologies	07180	coating reagent
ZE5 Cell Analyzer	Bio-Rad	na	flow cytomery