A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

Pseudomonas aeruginosa מייצר את biosurfactants rhamnolipid. כרומטוגרפיה בשכבה דקה מזהה וקובעת את שיעור המונו-רמנוליפידים והדי-רמנוליפידים המיוצרים על ידי כל זן. כימות של סך כל הרמנוליפידים כרוך בהערכת מקבילות של רמנוז הקיימות בביו-פעילי שטח אלה המופקים מתרבית העל-נאטנטים בשיטת אורצינול.

Abstract

החיידק הסביבתי Pseudomonas aeruginosa הוא פתוגן אופורטוניסטי בעל עמידות גבוהה לאנטיביוטיקה המהווה סכנה בריאותית. חיידק זה מייצר רמות גבוהות של ביו-פעילי שטח המכונים רמנוליפידים (RL), שהן מולקולות בעלות ערך ביוטכנולוגי משמעותי אך קשורות גם לתכונות אלימות. מבחינה זו, זיהוי וכימות של RL עשוי להיות שימושי הן עבור יישומים ביוטכנולוגיים והן עבור פרויקטים של מחקר ביו-רפואי. במאמר זה, אנו מדגימים שלב אחר שלב את הטכניקה לזיהוי הייצור של שתי צורות RL המיוצרות על ידי P. aeruginosa באמצעות כרומטוגרפיה שכבה דקה (TLC): מונו-רמנוליפידים (mRL), מולקולות המורכבות על ידי דימר של חומצות שומן (בעיקר C10-C10) הקשורות למויטי רמנוז אחד, ודי-רמנוליפידים (dRL), מולקולות המורכבות על ידי דימר חומצת שומן דומה המקושר לשני מואייטים של רמנוז. בנוסף, אנו מציגים שיטה למדידת הכמות הכוללת של RL בהתבסס על הידרוליזה חומצית של ביו-פעילי שטח אלה המופקים מסופרנאטנט תרבית P. aeruginosa והזיהוי הבא של ריכוז הרמנוז המגיב עם אורצינול. ניתן להשתמש בשילוב של שתי הטכניקות כדי להעריך את הריכוז המשוער של mRL ו-dRL המיוצר על ידי זן מסוים, כפי שמודגם כאן עם הזנים PAO1 (פילוגרופ 1), PA14 (פילוגרופ 2) ו-PA7 (פילוגרופ 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa הוא חיידק סביבתי ופתוגן אופורטוניסטי בעל דאגה רבה בשל ייצורו של תכונות הקשורות לאלימות ועמידותו הגבוהה לאנטיביוטיקה ^1,2. מטבוליט משני אופייני המיוצר על ידי חיידק זה הוא RL biosurfactant, אשר מיוצר באופן מתואם עם מספר תכונות הקשורות לאלימות כגון פנזין pyocyanin, אנטיביוטיקה עם פעילות חמצון-חיזור, ואת פרוטאז elastase³. תכונות הטנסיו-אקטיביות והתחליב של RL נוצלו ביישומים תעשייתיים שונים וכיום הן ממוסחרות⁴.

רוב זני P. aeruginosa, השייכים לקבוצות פילוגרופ 1 ו-2, מייצרים שני סוגים של RL: mRL, המורכב ממויטי רמנוז אחד המקושר לדימר חומצת שומן המורכב בעיקר מ-10 פחמנים, ו-dRL, המכיל רמנוז מואטי נוסף הקשור לרמנוז⁴ הראשון (ראו איור 1). עם זאת, דווח כי שתי קבוצות פילוגרופ מינוריות של P. aeruginosa (קבוצות 3 ו -5) מייצרות רק mRL ^5,6. שני סוגי RL מכילים תערובת של דימרים של חומצות שומן, שכאמור הם בעיקר C10-C10, אך מיוצרים גם פרופורציות קטנות יותר של מולקולות המכילות דימרים C12-C10, C12-C12 ו-C10-C12:1. אפיון קונגנרי RL המיוצרים על ידי זנים שונים באמצעות HPLC MS/MS דווח ^7,8. השיטות המתוארות בעבודה זו יכולות רק להבדיל בין mRL ו- dRL אך אינן יכולות לשמש לאפיון של קונגנרים RL.

P. aeruginosa וכמה מיני Burkholderia הם יצרנים טבעיים של RL⁹, אבל החיידק לשעבר הוא היצרן היעיל ביותר. עם זאת, RL בשימוש מסחרי מיוצר כיום בנגזרות Pseudomonas putida KT2440 המבטאות גנים P. aeruginosa כדי למנוע את השימוש בפתוגן אופורטוניסטי^{זה 10,11}. לגילוי וכימות של RL המיוצר על ידי P. aeruginosa חשיבות רבה לחקר המנגנונים המולקולריים המעורבים בביטוי תכונות הקשורות לאלימות¹², באפיון זנים השייכים לקלאדים 3 או 5¹³, ובבניית נגזרות P. aeruginosa המייצרות יתר על המידה ביו-פעילי שטח אלה תוך הפחתת האלימות¹⁴. הייצור של biosurfactants על ידי מיקרואורגניזמים שונים זוהה מבוסס על כמה מאפיינים כלליים של תרכובות אלה, כגון שיטת נפילת קריסה או מדד תחליב¹⁵, אבל שיטות אלה אינן מדויקות או ספציפיות¹⁶.

במאמר זה אנו מתארים את הפרוטוקול לזיהוי mRL ו-dRL באמצעות מיצוי נוזלי של סך כל ה-RL מתרבית העל-נאטנטים של זנים שונים מסוג P. aeruginosa, וההפרדה של שני סוגי RL באמצעות TLC. בשיטה זו, ה-RL המופק מהתרבית מופרד על ידי המסיסות הדיפרנציאלית שלהם בממסים המשמשים ל-TLC, מה שגורם לנדידה דיפרנציאלית על צלחת ג’ל הסיליקה. לכן, mRL יש הגירה מהירה יותר מאשר dRL, והם יכולים להיות מזוהים כתמים נפרדים כאשר לוחות מיובשים ומוכתמים עם α-naphthol.

השיטה המתוארת כאן לאיתור mRL ו- dRL על ידי TLC מבוססת על מאמר¹⁷ שפורסם בעבר, שהוא קל לביצוע ואינו דורש ציוד יקר. שיטה זו הייתה שימושית לאיתור RL במבודדי P. aeruginosa ^{שונים 13} באמצעות בקרות מתאימות, כגון מוטציה שמקורה ב-P. aeruginosa שאינה מסוגלת לייצר RL. עם זאת, זו אינה השיטה המועדפת לאפיון ביו-פעילי שטח חדשים המיוצרים על ידי חיידקים שאינם Pseudomonas aeruginosa בשל חוסר הספציפיות שלה.

בנוסף, מוצגת שיטה לכימות המקבילות של RL הכולל המופק מסופרנאטנט תרבית P. aeruginosa . שיטה זו מכמתת ביו-פעילי שטח אלה בהתבסס על התגובה של אורצינול עם סוכרים רדוקטיביים, וכתוצאה מכך נוצר מוצר שניתן למדוד ספקטרופוטומטרית ב-421 ננומטר, כפי שתואר קודם לכן¹⁸. מכיוון שהתגובה עם אורצינול אינה ספציפית לרמנוז, חשוב לבצע שיטה זו עם RL המופק מתרבית העל שאינה מכילה כמויות משמעותיות של מולקולות אחרות המכילות סוכר, כגון ליפופוליסכרידים (LPS). תערובת כלורופורם/מתנול חומצית משמשת כאן למיצוי נוזלי של RL¹⁸, אך ניתן להשתמש גם באתיל אצטט, ומיצוי בשלב מוצק (SPE) מניב תוצאות טובות מאוד¹⁹. שיטת האורצינול המתוארת כאן אינה דורשת ציוד מתוחכם ויכולה לספק תוצאות אמינות אם מבוצעת בזהירות מיוחדת בהכנת הדגימות המנותחות, כפי שנדון. כדי להבטיח הכנת דגימה נאותה, חשוב לכלול מוטנט Pseudomonas aeruginosa rhlA שאינו מסוגל לייצר RL²⁰ ולבצע שלושה שכפולים ביולוגיים ושלושה טכניים לכל קביעה.

הייתה מחלוקת משמעותית בספרות^16,21 לגבי קביעת RL בשיטת אורצינול, כאשר כמה מחקרים מציעים כי ייצור RL מוערך יתר על המידה וכי הבדיקה חסרה ספציפיות עבור rhamnose, פוטנציאל גילוי סוכרים אחרים. עם זאת, אנו מראים כאן כי השיטות המתוארות יכולות להיות מדויקות וספציפיות בתנאים המתאימים. יתר על כן, לצורך השוואה עם ההליכים המתוארים במאמר זה, אנו משתמשים בזיהוי UPLC-MS/MS של תקן dRL ומדגימים כי תוצאות דומות מתקבלות בשיטת אורצינול. הפרוטוקול המפורט לכימות RL בשיטה זו כלול בקובץ משלים 1.

פרוטוקולים אלה מודגמים באמצעות זני הסוג PAO1 (פילוגרופ 1), PA14 (פילוגרופ 2) ו-PA7 (פילוגרופ 3). זנים אלה נבחרו מכיוון שהם מאופיינים היטב ומייצרים פרופילי RL שונים.

Protocol

הליך זה מסוכם באיור משלים 1. הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים. 1. זיהוי mRL ו-dRL בתרבית סופרנאטנטים של P. aeruginosa באמצעות TLC התחל עם מרק צנטריפוגה של זן P. aeruginosa של עניין, מעובד בתווך נוזלי במשך 24 שעות (כ…

Representative Results

במאמר זה, שלושה זנים שונים מסוג P. aeruginosa שימשו כדי לייצג שלוש פילוקבוצות, כל אחת עם רמות ייצור RL שונות ופרופורציות שונות של mRL ו- dRL. זנים אלה כוללים PAO1 (מבודד פצע מאוסטרליה, 195522), PA14 (צמח מבודד מארה”ב, 197723), ו- PA7 (מבודד קליני מארגנטינה, 201024). כבקרה שלילית, נעש?…

Discussion

השיטה המדויקת ביותר לגילוי וכימות RL היא HPLC בשילוב ספקטרומטריית מסות (MS)^7,8,27; עם זאת, זה דורש ציוד מיוחד ויקר כי לא יכול להיות נגיש לחוקרים רבים. השיטות המתוארות כאן יכולות להתבצע באופן שגרתי עם חומרי מעבדה בסיסיים וציוד כדי לזהות ולהעריך רי…

Materials

1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C