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Summary

Pseudomonas aeruginosa produce los biosurfactantes ramnolípidos. La cromatografía en capa fina detecta y determina la proporción de mono y di-ramnolípidos producidos por cada cepa. La cuantificación de los ramnolípidos totales implica la evaluación de los equivalentes de ramnosa presentes en estos biosurfactantes extraídos de los sobrenadantes de cultivo mediante el método de orcinol.

Abstract

La bacteria ambiental Pseudomonas aeruginosa es un patógeno oportunista con alta resistencia a los antibióticos que representa un peligro para la salud. Esta bacteria produce altos niveles de biosurfactantes conocidos como ramnolípidos (RL), que son moléculas con un importante valor biotecnológico pero que también se asocian a rasgos de virulencia. En este sentido, la detección y cuantificación de RL puede ser útil tanto para aplicaciones biotecnológicas como para proyectos de investigación biomédica. En este artículo, demostramos paso a paso la técnica para detectar la producción de las dos formas de RL producidas por P. aeruginosa mediante cromatografía en capa fina (TLC): mono-ramnolípidos (mRL), moléculas constituidas por un dímero de ácidos grasos (principalmente C10-C10) unido a una fracción de ramnosa, y di-ramnolípidos (dRL), moléculas constituidas por un dímero de ácido graso similar unido a dos partes de ramnosa. Además, presentamos un método para medir la cantidad total de RL basado en la hidrólisis ácida de estos biosurfactantes extraídos de un sobrenadante de cultivo de P. aeruginosa y la posterior detección de la concentración de ramnosa que reacciona con el orcinol. La combinación de ambas técnicas se puede utilizar para estimar la concentración aproximada de mRL y dRL producida por una cepa específica, como se ejemplifica aquí con las cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) y PA7 (filogrupo 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa es una bacteria ambiental y un patógeno oportunista de gran preocupación debido a su producción de rasgos asociados a la virulencia y su alta resistencia a los antibióticos ^1,2. Un metabolito secundario característico producido por esta bacteria es el biosurfactante RL, que se produce de forma coordinada con varios rasgos asociados a la virulencia como la fenazina piocianina, un antibiótico con actividad redox, y la proteasa^{elastasa 3}. Las propiedades tensioactivas y emulsificantes de RL han sido explotadas en diferentes aplicaciones industriales y actualmente se comercializan⁴.

La mayoría de las cepas de P. aeruginosa, pertenecientes a los filogrupos 1 y 2, producen dos tipos de RL: mRL, que consiste en una fracción de ramnosa unida a un dímero de ácidos grasos principalmente de 10 carbonos, y dRL, que contiene una fracción de ramnosa adicional unida a la primera ramnosa⁴ (ver Figura 1). Sin embargo, se ha reportado que dos filogrupos menores de P. aeruginosa (grupos 3 y 5) solo producen mRL ^5,6. Los dos tipos de RL contienen una mezcla de dímeros de ácidos grasos, que, como se mencionó, son principalmente C10-C10, pero también se producen proporciones más pequeñas de moléculas que contienen dímeros C12-C10, C12-C12 y C10-C12:1. Se ha reportado la caracterización de los congéneres RL producidos por diferentes cepas utilizando HPLC MS/MS ^7,8. Los métodos descritos en este trabajo solo pueden diferenciar entre mRL y dRL, pero no se pueden utilizar para la caracterización de los congéneres de RL.

P. aeruginosa y algunas especies de Burkholderia son productoras naturales de RL⁹, pero la primera bacteria es la productora más eficiente. Sin embargo, actualmente se produce RL de uso comercial en derivados de Pseudomonas putida KT2440 que expresan genes de P. aeruginosa para evitar el uso de este patógeno oportunista^10,11. La detección y cuantificación de RL producida por P. aeruginosa son de gran importancia para el estudio de los mecanismos moleculares implicados en la expresión de rasgos relacionados con la virulencia¹², en la caracterización de cepas pertenecientes a los clados 3 o 5¹³, y para la construcción de derivados de P. aeruginosa que sobreproduzcan estos biosurfactantes y tengan una virulencia reducida¹⁴. La producción de biosurfactantes por parte de diferentes microorganismos se ha detectado a partir de algunas características generales de estos compuestos, como el método de la gota de colapso o el índice de emulsificación¹⁵, pero estos métodos no son precisos ni específicos¹⁶.

En este trabajo se describe el protocolo para la detección de mRL y dRL mediante la extracción líquida de RL total a partir de los sobrenadantes de cultivo de diferentes cepas de tipo P. aeruginosa y la separación de ambos tipos de RL mediante TLC. En este método, los RL extraídos del sobrenadante de cultivo se separan por su solubilidad diferencial en los disolventes utilizados para el TLC, lo que provoca una migración diferencial en la placa de gel de sílice. Por lo tanto, los mRL tienen una migración más rápida que los dRL, y se pueden detectar como puntos separados cuando las placas se secan y se tiñen con α-naftol.

El método descrito aquí para la detección de mRL y dRL por TLC se basa en un artículo¹⁷ publicado anteriormente, que es fácil de realizar y no requiere equipos costosos. Este método ha sido útil para detectar RL en varios aislados de P. aeruginosa ¹³ utilizando controles apropiados, como un mutante derivado de P. aeruginosa incapaz de producir RL. Sin embargo, no es el método preferido para caracterizar nuevos biosurfactantes producidos por bacterias distintas de Pseudomonas aeruginosa debido a su falta de especificidad.

Además, se presenta un método para cuantificar los equivalentes de ramnosa de RL total extraído de un sobrenadante de cultivo de P. aeruginosa . Este método cuantifica estos biosurfactantes a partir de la reacción del orcinol con azúcares reductores, dando como resultado un producto que puede medirse espectrofotométricamente a 421 nm, como se ha descrito anteriormente¹⁸. Dado que la reacción con orcinol no es específica de la ramnosa, es importante realizar este método con RL extraído del sobrenadante del cultivo que no contenga cantidades significativas de otras moléculas que contengan azúcares, como los lipopolisacáridos (LPS). Aquí se utiliza una mezcla acidificada de cloroformo y metanol para la extracción líquida de RL¹⁸, pero también se puede utilizar acetato de etilo, y la extracción en fase sólida (SPE) da muy buenos resultados¹⁹. El método de orcinol descrito aquí no requiere equipos sofisticados y puede proporcionar resultados confiables si se realiza con especial cuidado en la preparación de las muestras analizadas, como se discutió. Para garantizar una preparación adecuada de la muestra, es importante incluir un mutante de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapaz de producir RL²⁰ y realizar tres réplicas biológicas y tres técnicas para cada determinación.

Ha existido una importante controversia en la literatura^16,21 en relación a la determinación de RL por el método de orcinol, con algunos estudios que sugieren que la producción de RL está sobreestimada y que el ensayo carece de especificidad para la ramnosa, potencialmente detectando otros azúcares. Sin embargo, demostramos aquí que los métodos descritos pueden ser precisos y específicos en las condiciones adecuadas. Además, para la comparación con los procedimientos descritos en este artículo, utilizamos la detección UPLC-MS/MS de un estándar dRL y demostramos que se obtienen resultados similares con el método orcinol. El protocolo detallado para cuantificar el RL utilizando este método se incluye en el Archivo Complementario 1.

Estos protocolos se ejemplifican utilizando las cepas tipo PAO1 (filogrupo 1), PA14 (filogrupo 2) y PA7 (filogrupo 3). Se eligieron estas cepas porque están bien caracterizadas y producen diferentes perfiles de RL.

Protocol

Este procedimiento se esquematiza en la Figura Suplementaria 1. Los reactivos y equipos utilizados para el estudio se enumeran en la Tabla de Materiales. 1. Detección de mRL y dRL en sobrenadantes de cultivo de P. aeruginosa mediante TLC Comenzar con el caldo centrifugado de la cepa de interés P . aeruginosa , cultivado en medio líquido durante 24 h (para llegar a la fase estacio…

Representative Results

En este artículo, se utilizaron tres cepas diferentes de P. aeruginosa para representar tres filogrupos, cada uno con diferentes niveles de producción de RL y proporciones de mRL y dRL. Estas cepas incluyen PAO1 (un aislado de herida de Australia, 195522), PA14 (un aislado de planta de los EE. UU., 197723) y PA7 (un aislado clínico de Argentina, 201024). Como control negativo, se empleó el mutante PAO1 rhlA, que es incapaz de producir RL…

Discussion

El método más preciso para detectar y cuantificar el RL es la HPLC acoplada a la espectrometría de masas (MS)^7,8,27; Sin embargo, requiere equipos especializados y costosos que pueden no ser accesibles para muchos investigadores. Los métodos descritos aquí se pueden realizar de forma rutinaria con materiales y equipos básicos de laboratorio para detectar y estimar las concentraciones de RL, pero tienen algunas limitaciones…

Materials

1-NAPHTHOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACETIC ACID	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGE			For centrifuging tubes 1.5 mL and  50 mL
CHLOROFORM	J.T. BAKER	9180-02
DRYING OVEN
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
GLASS PIPETTE	SIGMA-ALDRICH	CLS706510
HYDROCHLORIC ACID	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	R-3875
METHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
PPGAS Broth			Tris HCL (0.12M), Potassium Chloride ( 0.02M) Ammonium Chloride (0.02M),  Peptone (1%), pH 7.4   Autoclaved. Add  Glucose (5%) and Magnesium Sulfate (0.0016M)
QUARTZ CELL (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAR TLC DEVELOPING TANK	FISHER SCIENTIFIC	K4161801020
RHAMNOLIPIDS	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMETER			VIS
SPRAYER	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
SULFURIC ACID	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
WATER BATH			> 80 °C