Här presenterar vi ett protokoll för testet för att undvika aktiv plats, ett hippocampus-beroende spatialt inlärningsparadigm designat för gnagare. Ändring av nyckelparametrar gör det möjligt att testa djuren på nytt före och efter behandlingar eller över tid.
Hippocampus-beroende rumslig inlärning hos gnagare har testats med en mängd olika metoder. Dessa inkluderar Morris vattenlabyrint (MWM), Y-labyrint och nya objektlokaliseringsuppgifter (NOL). På senare tid har uppgiften att undvika aktiv plats (APA) utvecklats som ett alternativ till dessa mer traditionella metoder. I APA-uppgiften måste möss använda rumsliga signaler placerade runt en roterande arena för att undvika en stationär chockzon. På grund av de många parametrar som kan justeras har APA-uppgiften visat sig vara ett mycket mångsidigt tillvägagångssätt. Den lämpar sig för att användas longitudinellt och upprepade gånger för samma kohort av möss. Här tillhandahåller vi ett detaljerat protokoll för att framgångsrikt utföra APA-uppgiften. Vi lyfter också fram alternativa APA-metoder som kan användas för att undersöka olika komponenter i rumsligt lärande. Vi beskriver datainsamlings- och analysprocesserna. Kritiska steg under APA-uppgiften diskuteras för att öka sannolikheten för att testet ska kunna genomföras framgångsrikt. APA-uppgiften har flera fördelar jämfört med mer traditionella tester av rumslig navigering. Det är lämpligt att använda med åldrade möss eller de med sjukdomsfenotyper som Alzheimers sjukdom. Uppgiftens komplexitet kan enkelt ändras, vilket gör att ett brett spektrum av musstammar kan testas. Vidare är APA-uppgiften lämplig för att testa djur som har genomgått kirurgi eller experimentella ingrepp som kan ha påverkat motorisk eller neural funktion, såsom stroke eller traumatisk hjärnskada.
Aktivt platsundvikande (APA) är ett effektivt verktyg för att testa hippocampus-beroende rumslig inlärning hos gnagare 1,2,3,4. Under APA-uppgiften placeras djuret på en roterande arena och måste använda visuella signaler för att orientera sig och undvika en motbjudande chockzon5. Rotationen av arenan säkerställer att musen inte kan använda ett idiotetiskt tillvägagångssätt för navigering, och inte heller kan doftmärken användas, eftersom dessa signaler roterar på plattformen medan chockzonen förblir stationär5. Genom att ändra hastigheten och riktningen på arenan, såväl som placeringen av chockzonen och visuella signaler, kan mössen testas på nytt flera gånger 6,7,8. APA erbjuder flera tydliga fördelar jämfört med Morris vattenlabyrint (MWM), ett av de mest använda testerna för rumslig inlärning. Det är viktigt att möss har en aversion mot att simma och tycker att MWM-uppgiften ärextremt stressande. Vidare har åldrade möss rapporterats flyta under MWM-uppgift10, vilket gör den olämplig som en rumslig inlärningsuppgift i många fall. Dessutom, eftersom MWM-uppgiften kräver en dold, nedsänkt plattform för mössen att lokalisera under testningen. Detta kräver att vattnet är ogenomskinligt, vilket vanligtvis uppnås genom tillsats av vit färg. Spårning och analys av djur under beteendemässiga uppgifter kräver tillräcklig kontrast mellan försöksperson och omgivning, vilket utesluter att vissa musstammar som Swiss eller BALB/c testas i MWM. I APA-uppgiften kringgås detta problem genom att svart plast läggs till under gallret.
Flera APA-paradigm har utformats för att testa rumslig inlärning, vilket visar dess användbarhet som ett effektivt beteendeverktyg. Till exempel åstadkoms förvärv, bevarande och konsolidering av rumslig inlärning vanligtvis genom dagliga tester av djur som kan variera från 3-5 dagar 6,7,11,12. Minne och inlärning kvantifieras genom att jämföra antalet stötar som mottagits varje förvärvsdag. Tid till första ingång och den maximala tiden för att undvika chockzonen är också viktiga parametrar som kan användas för att bestämma förändringar i inlärningsförmåga under uppgiften. Alternativt kan spatialt arbetsminne testas genom att genomföra en enda 30 minuters APA-session 2,13 där spatial inlärning mäts som förändringar inom sessionen genom att jämföra prestanda, såsom chocknummer, i 5 minuters bins.
I den här artikeln beskriver vi APA-uppgiften och lyfter fram de viktigaste funktionerna som måste beaktas när du genomför detta rumsliga inlärningstest.
Sammanfattningsvis är testet för undvikande av aktiv plats en effektiv rumslig inlärningsuppgift som kan användas på en mängd olika musstammar och experimentella förhållanden. APA-uppgiften övervinner begränsningar som är förknippade med andra paradigm för rumslig inlärning14, såsom MWM, som är stressande för mössen mätt med kortisolnivåer9. MWM är också olämplig för åldrade möss, där de har rapporterats flyta under uppgift10. Även om andra spatiala inlärningstester, som Barnes-labyrinten och novel object location test, är mindre stressande, är de begränsade av hur ofta upprepade tester kan utföras på samma kohort av möss. Därför är den största fördelen med APA-uppgiften att den kan användas flera gånger eftersom flera parametrar kan justeras för att upprätthålla nyheten. Faktum är att vi har använt APA-uppgiften upp till 5 gånger på samma kohort av möss för att undersöka effekten av hippocampusablation och den efterföljande effekten av träning8. I varje fall ändrades parametrarna, inklusive arenans rotation, chockzon och rumsliga ledtrådar, mellan testerna. Detta var effektivt för att säkerställa att mössen använde rumsliga navigeringssignaler för att lära sig uppgiften på nytt, vilket framgår av att kontrolldjuren började med ett stort antal stötar och sedan minskade under efterföljande testdagar för varje testperiod8. Vanligtvis, i slutet av ett 5-dagars testparadigm, anser vi att alla djur som fick mer än 10 stötar den sista dagen eller har en maximal undvikande på mindre än 60 s inte har lärt sig paradigmet.
Utöver möjligheten att enkelt ändra inställningar för att tillåta flera omgångar av rumslig testning, säkerställer APA-uppgiften att möss måste använda rumslig navigering för att effektivt undvika chockzonen. Till exempel måste djur använda externa signaler för att lokalisera och undvika att gå in i den stationära chockzonen genom att navigera bort från den5. Eftersom arenan roterar kan djuren inte använda ett idiotetiskt tillvägagångssätt för navigering, och de kan inte heller använda exteroceptiva signaler som lukt eftersom dessa signaler roterar med arenan medan chockzonen och de rumsliga signalerna förblir stationära5.
Det är också viktigt att se till att mössen är tillräckligt vana vid forskar- och APA-arenan. Intensiteten i fotstöten måste också optimeras, eftersom både för låg och för hög stötintensitet kan äventyra mössens förmåga att lära sig och utföra uppgiften5. Chockintensiteten är vanligtvis inställd på 0.5 mA och bör inte överstiga 0.7 mA. För djur som har ökat ångestliknande beteende, överväg att minska både ljusintensiteten och stötintensiteten i foten. Ökad ångest under APA-uppgiften kan visa sig som antingen överdrivet hoppande, okontrollerad löpning inom arenan eller långvarig frysning. Protokollet som beskrivs här använde en chockintensitet på 0,5 mA, samma intensitet som tidigare har använts med BALB/c, som är känt för att ha ett högre ångestliknande beteende15.
Här beskriver vi den programvara för djurspårning som tillhandahålls av företaget som tillhandahöll den aktiva riggen för undvikande av aktiv plats som användes. Alternativ programvara för videospårning är också lämplig för att analysera beteendemässiga prestationer. Dessa program kan också noggrant mäta och analysera musens prestanda under APA-uppgifter. Dessa program gör det möjligt att skapa flera zoner och platser inom APA-arenan för att bedöma beteendet. Arenans inställning för en APA består av en triangulär chockzon, där antalet ingångar, tid till första inträde och tid som tillbringas i chockzonen mäts. Ytterligare zoner kan också läggas till inom arenan. Vi kan till exempel lägga till en central zon eller en zon mittemot chockzonen för att mäta den tid som spenderas, och tillryggalagd sträcka i dessa zoner som en djurstrategi för att undvika den motbjudande zonen. Dessa program spårar musens tyngdpunkt, som sedan sparas och visas ovanför referensramen för visuell inspektion (Figur 6A,B). Slutligen är det också möjligt att skapa en densitetsvärmekarta för individuell och gruppprestation (Figur 6C).
När APA-uppgiften utförs finns det potentiella problem som måste åtgärdas. Ibland måste möss uteslutas från analysen på grund av att de inte svarar på chockzonen. Som alltid bör uteslutning endast övervägas när de uppfyller fördefinierade avvikande villkor, till exempel om de faller utanför 2 standardavvikelser från medelvärdet. Komplexa beteendeuppgifter som APA kräver vanligtvis höga N-värden hos djur. Vi föreslår att du genomför en effektanalys för att beräkna lämplig provstorlek innan du genomför APA. Detta beror på vilken stam som används och behandlingsgrupper. Av erfarenhet finner vi att ett n-värde på 10 eller mer för varje grupp ger tillräcklig effekt när man utför APA-experiment. Det största problemet med den här uppgiften är att säkerställa högkvalitativ spårning av musen under uppgiften. Tillvänjningsstadiet av uppgiften bör användas för att bekräfta att detta sker. Möss som inte svarar på en stöt beror ofta på spillning mellan gallerstängerna. Det är därför viktigt att rengöra riggen efter varje djur och ta bort eventuell spillning eller urin. Detta kommer också att minska stressen för djuren som följer efter. APA-uppgiften omfattar vanligtvis ett 5-dagarsparadigm, vilket kan innebära vissa begränsningar för studier som involverar interventioner som är effektiva mindre än 5 dagar; Korttidsminnet eller inlärningen av spatial inlärning kan dock fortfarande bedömas för sådana studier med hjälp av en 30 minuter lång metod med en enda session.
Sammanfattningsvis ger den här artikeln en detaljerad beskrivning av hur man ställer in och använder paradigmet för att undvika aktiv plats för att testa den rumsliga inlärningen hos möss. Möjligheten att ändra förhållanden så att flera musstammar av olika färg kan testas är en klar fördel jämfört med andra, mer traditionella spatiala tester som MWM. Dessutom möjliggör modifieringen av flera parametrar upprepade tester så att förändringarna i rumslig inlärning kan jämföras exakt under olika experimentella paradigm eller under fysiologiskt åldrande. På kort tid har APA-testet visat sig vara ett exakt och effektivt alternativ för hippocampus-beroende rumslig inlärning. I framtiden kan APA-uppgiften användas som en tillförlitlig metod för att bedöma terapeutiska eller träningsinterventioner på kognitivt och rumsligt beteende hos både vildtypsmöss och transgena möss.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Queensland Brain Institute (QBI) Animal Behaviour Facility för utvecklingen och underhållet av den apparat som beskrivs i detta manuskript.
Constant Current Source CS02 | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Control Box | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Ethovision | Noldus | version 16 | Wageningen, Netherlands |
Shock Scrambler | BioSignal Group | N/A | Acton, Massachusetts, United States |
Track Analysis | BioSignal Group | version 2.2 | Acton, Massachusetts, United States |
Tracker Programme | BioSignal Group | version: 2.36 | Acton, Massachusetts, United States |