Her præsenterer vi en protokol for en alsidig adfærdstest, der er udviklet for nylig, stigebjælketesten. Denne test har den fordel, at den påviser subtil cerebellar ataksi forårsaget af en defekt i skjoldbruskkirtelhormonets virkning i centralnervesystemet i forhold til de konventionelle adfærdstests, der vurderer motorisk ydeevne.
Skjoldbruskkirtelhormon (TH) virkning er afgørende under udviklingen af centralnervesystemet, herunder lillehjernen. I tilfælde af TH-mangel tidligt i livet, såsom medfødt hypothyroidisme, udviser patienter neurologiske lidelser såsom kognitiv retardering og motoriske underskud. Der er forskellige undersøgelser ved hjælp af musemodeller med vævs- eller cellespecifik TH-mangel for at undersøge TH’s rolle i lillehjernen. Sammenlignet med generaliserede medfødte hypothyreoideamus udviser cerebellare cellespecifikke TH-mangelmus mildere og mere subtile ataktiske træk, hvilket gør vurderingen af motorisk funktion vanskelig, når man bruger konventionelle tests såsom rotarod-testen.
På grund af behovet for et alternativt værktøj til at vurdere motorisk funktion i TH-relaterede dyremodeller, udviklede vi en alsidig adfærdsmetode kaldet “stigebjælketesten”, hvor vi kan designe de forskellige stigetest afhængigt af sværhedsgraden af ataksi i modelmus. Vi brugte transgene mus, der udtrykker en dominant-negativ TH-receptor specifikt i cerebellar Purkinje-cellen, en eneste outputneuron i cerebellar cortex, der modulerer motorisk ydeevne. Den nybyggede stigebjælketest påviste med succes robuste forringelser i motorisk ydeevne hos de transgene mus på et højere niveau sammenlignet med rotarodtesten. Forstyrrelse af motorisk indlæring blev også påvist i stigebjælketesten, men ikke i rotarodtesten. Protokollen med dette nye adfærdsapparat kan anvendes på andre dyremodeller, der kan vise mild ataktisk fænotype for at undersøge subtile ændringer i cerebellar funktion.
Skjoldbruskkirtelhormon (TH) er uundværligt for hjernens udvikling1. Især er dens rolle i lillehjernen kritisk, fordi TH-mangel i det tidlige liv forårsager afvigende cerebellar udvikling 1,2. For eksempel ved medfødt hypothyroidisme udviser patienter en række neurologiske retarderinger, herunder kognitive og motoriske underskud3. For at afsløre TH’s rolle i cerebellar funktionel udvikling har nogle undersøgelser begrænset TH-mangel på en cerebellar cellespecifik måde4. Men sammenlignet med generaliserede medfødte hypothyreoidea-mus, hvor alle væv og celler er påvirket af TH-mangel, udviser sådanne cerebellar-specifikke modeller så subtil ataksi, at de konventionelle adfærdstests, såsom rotarod-, fodaftryks- og balancebomtest, knap nok registrerer forskellene. For fuldt ud at undersøge TH-effekterne på cerebellar funktion er der derfor behov for et nyt vurderingsværktøj til at opdage en subtil ændring i den motoriske koordination af modelmus.
Rotarod-testen er det mest almindelige værktøj til vurdering af motorisk koordination, oprindeligt udviklet af Dunham og Miya5 og senere anvendt på en accelererende version af Jones og Roberts6. Latenstiden til at falde fra den roterende stang fortolkes som testen for motorisk koordination, og dens enkelhed og kortfattethed gør den almindeligt brugt blandt adfærdsforskere, der studerer motorisk funktion7. Brugervenligheden af denne test er dog et tveægget sværd. Fordi stangen automatisk roterer, kan mus klamre sig til og blive på den roterende stang uden at bevæge sig. Desuden kan mus have til hensigt at falde af i stedet for at blive ved med at balancere på den roterende stang. I begge situationer er testens gyldighed og pålidelighed tvivlsom for vurderingen af “ren motorisk koordination”7. Med andre ord er det ikke nøjagtigt rettet mod lillehjernens funktion og involverer andre faktorer såsom muskelstyrke til greb.
I stedet for de konventionelle værktøjer til vurdering af motorisk koordination præsenterer vi her en ny adfærdstest kaldet “stigebjælketesten”, som for nylig er udviklet i vores laboratorium. Den horisontale stigegangstest blev designet til at vurdere lillehjernens relaterede komplekse motoriske evner: feed-forward forudsigelse og integration af bevægelse8. Testenheden var sammensat af fire stykker plexiglas med huller (figur 1). De fire plader blev forbundet parallelt med skruer og pinde indsat i hullerne på pladerne. To ydre plader blev brugt til at stabilisere enheden, og to indvendige plader blev brugt til at designe de forskellige slags stigetrin (figur 2C). Bredden af trinnet blev justeret afhængigt af dyrestørrelsen for at minimere dyrenes bevægelse baglæns (figur 2B). Afstanden fra startpunktet til målet var 110 cm. Enheden var placeret 60 cm over bænken, og der blev sat en sikkerhedspude under enheden (figur 2A). Det mørke kammer blev placeret tæt på målet for at motivere dyrene til at bevæge sig mod målet (figur 2A).
Vi undersøgte TH-effekterne på cerebellar funktionel udvikling ved at bruge transgene mus, der udtrykker dominant-negativ TH-receptor (TR) i cerebellare Purkinje-celler (Mf-1/FVB-mus). I både rotarod- og stigestråletest observerede vi cerebellar ataktisk fænotype i Mf-1/FVB-mus; stigebjælketesten lykkedes dog at påvise mere signifikante forskelle end rotarodtesten (figur 3). Derudover kan motorisk indlæringsevne vurderes mere grundigt i stigebjælketest (figur 3B,C). Som en cellulær baggrund for en sådan adfærdsfænotype blev induktionen af langvarig depression (LTD) hæmmet, og i stedet blev langtidspotentiering (LTP) induceret efter en LTD-induktiv stimulering i Mf-1/FVB Purkinje-celler9. LTD er afgørende for motorisk koordination og motorisk indlæring i lillehjernen10. Mange undersøgelser har rapporteret motoriske underskud og hæmning af LTD i knockout eller muterede mus for nøgleregulatorgener i cerebellar funktion, men ingen undersøgelser har nogensinde rapporteret induktion af LTP efter en LTD-induktiv stimulering 11,12. Samlet set kan dette fænomen være unikt for Mf-1/FVB-mus eller TH-mangelfulde mus (det samme fænomen blev observeret hos hypothyreoidea-mus med voksen debut af hypothyreoidea), hvilket tyder på, at TH regulerer cerebellar funktion anderledes end de andre nøgleproteiner. Hvis det er tilfældet, er det plausibelt, at mus med unormal TH-virkning ikke udviser cerebellar ataksi på samme måde som andre modelmus. Dette understreger igen behovet for en specifik metode til at vurdere TH-effekter på cerebellar funktion. Denne artikel præsenterer en ny protokol til at undersøge TH-effekter på cerebellar funktion ved hjælp af den nybyggede stigebjælketest.
Vores design trak på den tidligere undersøgelse af Metz og Whishaw, som rapporterede nytten af “stigetrinsgangtesten”13,14. De designede stigetrinsgangtesten til at vurdere dygtig gang og måle både for- og bagbensplacering, skridt og koordination mellem lemmer ved at kræve, at dyrene går fra et udgangspunkt til et mål på en vandret stige 13,14. Det, der adskiller …
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (bevilling nr. 18H03379 til N.K., 21K15340 til I.A. og 22J11280 til A.N.).
Air puff | DAISO | ||
Aluminum sticks | CAINZ | 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval). | |
Blutack | Bostik | ||
Plexiglass | CAINZ | 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each | |
Screws | CAINZ |