Summary

En alsidig, adfærdsmæssig metode til at undersøge skjoldbruskkirtelhormons virkninger på cerebellar funktion

Published: October 06, 2023
doi:

Summary

Her præsenterer vi en protokol for en alsidig adfærdstest, der er udviklet for nylig, stigebjælketesten. Denne test har den fordel, at den påviser subtil cerebellar ataksi forårsaget af en defekt i skjoldbruskkirtelhormonets virkning i centralnervesystemet i forhold til de konventionelle adfærdstests, der vurderer motorisk ydeevne.

Abstract

Skjoldbruskkirtelhormon (TH) virkning er afgørende under udviklingen af centralnervesystemet, herunder lillehjernen. I tilfælde af TH-mangel tidligt i livet, såsom medfødt hypothyroidisme, udviser patienter neurologiske lidelser såsom kognitiv retardering og motoriske underskud. Der er forskellige undersøgelser ved hjælp af musemodeller med vævs- eller cellespecifik TH-mangel for at undersøge TH’s rolle i lillehjernen. Sammenlignet med generaliserede medfødte hypothyreoideamus udviser cerebellare cellespecifikke TH-mangelmus mildere og mere subtile ataktiske træk, hvilket gør vurderingen af motorisk funktion vanskelig, når man bruger konventionelle tests såsom rotarod-testen.

På grund af behovet for et alternativt værktøj til at vurdere motorisk funktion i TH-relaterede dyremodeller, udviklede vi en alsidig adfærdsmetode kaldet “stigebjælketesten”, hvor vi kan designe de forskellige stigetest afhængigt af sværhedsgraden af ataksi i modelmus. Vi brugte transgene mus, der udtrykker en dominant-negativ TH-receptor specifikt i cerebellar Purkinje-cellen, en eneste outputneuron i cerebellar cortex, der modulerer motorisk ydeevne. Den nybyggede stigebjælketest påviste med succes robuste forringelser i motorisk ydeevne hos de transgene mus på et højere niveau sammenlignet med rotarodtesten. Forstyrrelse af motorisk indlæring blev også påvist i stigebjælketesten, men ikke i rotarodtesten. Protokollen med dette nye adfærdsapparat kan anvendes på andre dyremodeller, der kan vise mild ataktisk fænotype for at undersøge subtile ændringer i cerebellar funktion.

Introduction

Skjoldbruskkirtelhormon (TH) er uundværligt for hjernens udvikling1. Især er dens rolle i lillehjernen kritisk, fordi TH-mangel i det tidlige liv forårsager afvigende cerebellar udvikling 1,2. For eksempel ved medfødt hypothyroidisme udviser patienter en række neurologiske retarderinger, herunder kognitive og motoriske underskud3. For at afsløre TH’s rolle i cerebellar funktionel udvikling har nogle undersøgelser begrænset TH-mangel på en cerebellar cellespecifik måde4. Men sammenlignet med generaliserede medfødte hypothyreoidea-mus, hvor alle væv og celler er påvirket af TH-mangel, udviser sådanne cerebellar-specifikke modeller så subtil ataksi, at de konventionelle adfærdstests, såsom rotarod-, fodaftryks- og balancebomtest, knap nok registrerer forskellene. For fuldt ud at undersøge TH-effekterne på cerebellar funktion er der derfor behov for et nyt vurderingsværktøj til at opdage en subtil ændring i den motoriske koordination af modelmus.

Rotarod-testen er det mest almindelige værktøj til vurdering af motorisk koordination, oprindeligt udviklet af Dunham og Miya5 og senere anvendt på en accelererende version af Jones og Roberts6. Latenstiden til at falde fra den roterende stang fortolkes som testen for motorisk koordination, og dens enkelhed og kortfattethed gør den almindeligt brugt blandt adfærdsforskere, der studerer motorisk funktion7. Brugervenligheden af denne test er dog et tveægget sværd. Fordi stangen automatisk roterer, kan mus klamre sig til og blive på den roterende stang uden at bevæge sig. Desuden kan mus have til hensigt at falde af i stedet for at blive ved med at balancere på den roterende stang. I begge situationer er testens gyldighed og pålidelighed tvivlsom for vurderingen af “ren motorisk koordination”7. Med andre ord er det ikke nøjagtigt rettet mod lillehjernens funktion og involverer andre faktorer såsom muskelstyrke til greb.

I stedet for de konventionelle værktøjer til vurdering af motorisk koordination præsenterer vi her en ny adfærdstest kaldet “stigebjælketesten”, som for nylig er udviklet i vores laboratorium. Den horisontale stigegangstest blev designet til at vurdere lillehjernens relaterede komplekse motoriske evner: feed-forward forudsigelse og integration af bevægelse8. Testenheden var sammensat af fire stykker plexiglas med huller (figur 1). De fire plader blev forbundet parallelt med skruer og pinde indsat i hullerne på pladerne. To ydre plader blev brugt til at stabilisere enheden, og to indvendige plader blev brugt til at designe de forskellige slags stigetrin (figur 2C). Bredden af trinnet blev justeret afhængigt af dyrestørrelsen for at minimere dyrenes bevægelse baglæns (figur 2B). Afstanden fra startpunktet til målet var 110 cm. Enheden var placeret 60 cm over bænken, og der blev sat en sikkerhedspude under enheden (figur 2A). Det mørke kammer blev placeret tæt på målet for at motivere dyrene til at bevæge sig mod målet (figur 2A).

Vi undersøgte TH-effekterne på cerebellar funktionel udvikling ved at bruge transgene mus, der udtrykker dominant-negativ TH-receptor (TR) i cerebellare Purkinje-celler (Mf-1/FVB-mus). I både rotarod- og stigestråletest observerede vi cerebellar ataktisk fænotype i Mf-1/FVB-mus; stigebjælketesten lykkedes dog at påvise mere signifikante forskelle end rotarodtesten (figur 3). Derudover kan motorisk indlæringsevne vurderes mere grundigt i stigebjælketest (figur 3B,C). Som en cellulær baggrund for en sådan adfærdsfænotype blev induktionen af langvarig depression (LTD) hæmmet, og i stedet blev langtidspotentiering (LTP) induceret efter en LTD-induktiv stimulering i Mf-1/FVB Purkinje-celler9. LTD er afgørende for motorisk koordination og motorisk indlæring i lillehjernen10. Mange undersøgelser har rapporteret motoriske underskud og hæmning af LTD i knockout eller muterede mus for nøgleregulatorgener i cerebellar funktion, men ingen undersøgelser har nogensinde rapporteret induktion af LTP efter en LTD-induktiv stimulering 11,12. Samlet set kan dette fænomen være unikt for Mf-1/FVB-mus eller TH-mangelfulde mus (det samme fænomen blev observeret hos hypothyreoidea-mus med voksen debut af hypothyreoidea), hvilket tyder på, at TH regulerer cerebellar funktion anderledes end de andre nøgleproteiner. Hvis det er tilfældet, er det plausibelt, at mus med unormal TH-virkning ikke udviser cerebellar ataksi på samme måde som andre modelmus. Dette understreger igen behovet for en specifik metode til at vurdere TH-effekter på cerebellar funktion. Denne artikel præsenterer en ny protokol til at undersøge TH-effekter på cerebellar funktion ved hjælp af den nybyggede stigebjælketest.

Protocol

Dyreforsøgsprotokollen i denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care and Experimentation Committee ved Gunma University. Alle procedurer for pleje og behandling af dyr blev udført i henhold til den japanske lov om dyrevelfærd og forvaltning og retningslinjerne for korrekt udførelse af dyreforsøg udstedt af Japans videnskabelige råd. Monteringstegningen af apparatet findes i figur 1. 1. Opsætning af stige…

Representative Results

I rotarod-testen viste Mf-1/FVB-mus et signifikant fald i latenstiden til at falde fra den roterende stang over 3 på hinanden følgende dage sammenlignet med vildtypemusene, hvilket indikerer nedsat motorisk koordination (figur 3A). Men med hensyn til resultater inden for gruppen forbedrede Mf-1/FVB-mus signifikant deres ydeevne fra dag 1 til dag 3, hvilket tyder på bevarelse af motorisk indlæring (figur 3A</s…

Discussion

Vores design trak på den tidligere undersøgelse af Metz og Whishaw, som rapporterede nytten af “stigetrinsgangtesten”13,14. De designede stigetrinsgangtesten til at vurdere dygtig gang og måle både for- og bagbensplacering, skridt og koordination mellem lemmer ved at kræve, at dyrene går fra et udgangspunkt til et mål på en vandret stige 13,14. Det, der adskiller …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af Japan Society for the Promotion of Science KAKENHI (bevilling nr. 18H03379 til N.K., 21K15340 til I.A. og 22J11280 til A.N.).

Materials

Air puff DAISO
Aluminum sticks CAINZ 2 mm diameter, number of sticks may vary depending on the ladder design. Aproximately 30 sticks may be required to build the horizontal ladder (4 cm interval).
Blutack Bostik
Plexiglass CAINZ 110 cm x 20 cm, 110 cm x 10 cm, 2 parts each
Screws  CAINZ

References

  1. Koibuchi, N., Chin, W. W. Thyroid hormone action and brain development. Trends in Endocrinology and Metabolism. 11 (4), 123-128 (2000).
  2. Koibuchi, N. The role of thyroid hormone on functional organization in the cerebellum. Cerebellum. 12 (3), 304-306 (2013).
  3. Rastogi, M. V., Lafranchi, S. H. Congenital hypothyroidism. Orphanet Journal of Rare Diseases. 5, 17 (2010).
  4. Ishii, S., Amano, I., Koibuchi, N. The role of thyroid hormone in the regulation of cerebellar development. Endocrinology and Metabolism (Seoul). 36 (4), 703-716 (2021).
  5. Dunham, N. W., Miya, T. S. A note on a simple apparatus for detecting neurological deficit in rats and mice. The Journal of the American Pharmacists Association. 46 (3), 208-209 (1957).
  6. Jones, B. J., Roberts, D. J. The quantiative measurement of motor inco-ordination in naive mice using an acelerating rotarod. The Journal of Pharmacy and Pharmacology. 20 (4), 302-304 (1968).
  7. Lubrich, C., Giesler, P., Kipp, M. Motor behavioral deficits in the cuprizone model: Validity of the rotarod test paradigm. International Journal of Molecular Sciences. 23 (19), 11342 (2022).
  8. Courchesne, E., Allen, G. Prediction and preparation, fundamental functions of the cerebellum. Learning and Memory. 4 (1), 1-35 (1997).
  9. Ninomiya, A., et al. Long-term depression-inductive stimulation causes long-term potentiation in mouse purkinje cells with a mutant thyroid hormone receptor. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 119 (45), e2210645119 (2022).
  10. Ito, M. Cerebellar long-term depression: Characterization, signal transduction, and functional roles. Physiological Reviews. 81 (3), 1143-1195 (2001).
  11. Miyata, M., et al. Deficient long-term synaptic depression in the rostral cerebellum correlated with impaired motor learning in phospholipase c beta4 mutant mice. The European Journal of Neuroscience. 13 (10), 1945-1954 (2001).
  12. Aiba, A., et al. Deficient cerebellar long-term depression and impaired motor learning in mglur1 mutant mice. Cell. 79 (2), 377-388 (1994).
  13. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. Cortical and subcortical lesions impair skilled walking in the ladder rung walking test: A new task to evaluate fore- and hindlimb stepping, placing, and co-ordination. The Journal of Neuroscience Methods. 115 (2), 169-179 (2002).
  14. Metz, G. A., Whishaw, I. Q. The ladder rung walking task: A scoring system and its practical application. Journal of Visualized Experiments. (28), (2009).
  15. Mendes, C. S., et al. Quantification of gait parameters in freely walking rodents. BMC Biology. 13 (1), 50 (2015).
  16. Cupido, A., et al. The Erasmus ladder: A new tool for the automated measurement of motor performance and motor learning in mice. Conference: Measuring behavior, Wageningen. , (2005).
  17. Sathyanesan, A., Kratimenos, P., Gallo, V. Disruption of neonatal purkinje cell function underlies injury-related learning deficits. The Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (11), e2017876118 (2021).
  18. Martins, L. A., Schiavo, A., Xavier, L. L., Mestriner, R. G. The foot fault scoring system to assess skilled walking in rodents: A reliability study. Frontiers in Behavioral Neuroscience. 16, 892010 (2022).
  19. Shimokawa, N., et al. Altered cerebellum development and dopamine distribution in a rat genetic model with congenital hypothyroidism. Journal of Neuroendocrinology. 26 (3), 164-175 (2014).
  20. Amano, I., et al. Aberrant cerebellar development in mice lacking dual oxidase maturation factors. Thyroid. 26 (5), 741-752 (2016).

Play Video

Cite This Article
Ninomiya, A., Amano, I., Koibuchi, N. A Versatile, Behavioral Method to Investigate Thyroid Hormone Effects on Cerebellar Function. J. Vis. Exp. (200), e65940, doi:10.3791/65940 (2023).

View Video