Denne studien introduserer en automatisert metode for å generere pasientavledede glioblastom 3-dimensjonale organoider ved hjelp av en vevshakker. Metoden gir en egnet og effektiv tilnærming for å oppnå slike organoider for terapeutisk testing.
Glioblastom, IDH-vill type, CNS WHO grad 4 (GBM) er en primær hjernesvulst assosiert med dårlig pasientoverlevelse til tross for aggressiv behandling. Utvikling av realistiske ex vivo-modeller er fortsatt utfordrende. Pasientavledede 3-dimensjonale organoide (PUD) modeller tilbyr innovative plattformer som fanger den fenotypiske og molekylære heterogeniteten til GBM, samtidig som nøkkelegenskapene til de opprinnelige svulstene bevares. Manuell disseksjon for PUD-generering er imidlertid tidkrevende, kostbart og kan gi flere uregelmessige og ujevne PUD-er. Denne studien presenterer en innovativ metode for PUD-produksjon ved hjelp av et automatisert vevshakker. Tumorprøver fra fire GBM og en astrocytom, IDH-mutert, CNS WHO grad 2 pasienter ble behandlet manuelt samt ved bruk av vevshakkeren. I den manuelle tilnærmingen ble tumormaterialet dissekert ved hjelp av skalpeller under mikroskopisk kontroll, mens vevshakkeren ble brukt i tre forskjellige vinkler. Etter dyrkning på orbitalshaker ved 37 °C ble morfologiske endringer evaluert ved lysfeltmikroskopi, mens proliferasjon (Ki67) og apoptose (CC3) ble vurdert med immunfluorescens etter 6 uker. Vevshakkermetoden reduserte nesten 70 % av produksjonstiden og resulterte i et signifikant høyere gjennomsnittlig antall PUD-er sammenlignet med det manuelt behandlede vevet fra den andre uken og utover (uke 2: 801 vs. 601, P = 0,018; uke 3: 1105 vs. 771, P = 0,032; og uke 4:1195 vs. 784, P < 0,01). Kvalitetsvurdering viste lignende frekvenser av tumorcelleapoptose og proliferasjon for begge produksjonsmetoder. Derfor tilbyr den automatiserte vevshakkermetoden en mer effektiv tilnærming når det gjelder tid og PUD-utbytte. Denne metoden holder løfte om legemiddel- eller immunterapi-screening av GBM-pasienter.
Lavgradige gliomer (LGG) er en gruppe relativt sjeldne hjernesvulster som vanligvis presenterer seg som saktevoksende og mindre aggressive sammenlignet med høyverdige gliomer som glioblastom. De kan forekomme hos både voksne og barn, med litt høyere forekomst hos voksne. Den eksakte forekomsten varierer etter region og befolkning, men LGG står for omtrent 15% -20% av alle primære hjernesvulster1. Behandlingsstrategier for LGGs involverer ofte en kombinasjon av kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, med sikte på å maksimere tumorreseksjon samtidig som nevrologisk funksjon opprettholdes. Håndteringen av LGG kan være kompleks, og valg av behandling kan avhenge av faktorer som tumorlokalisasjon og molekylære egenskaper2. Fremskritt i å forstå den genetiske og molekylære grunnlaget for LGGs har ført til mer målrettede terapier, og pågående forskning fortsetter å avgrense behandlingsmetoder.
Glioblastom, IDH-vill type, CNS WHO grad 4 (GBM), derimot, er den mest utbredte primære hjernesvulsten som er funnet hos voksne, med en forekomst mellom 3,19-4,17 tilfeller per 100 000 personår3. GBM forårsaker symptomer som hodepine, anfall, fokale nevrologiske underskudd, endringer i personlighet og økt intrakranielt trykk. Standard behandling for GBM innebærer debulking av svulsten, hvis mulig, etterfulgt av strålebehandling kombinert med Temozolomide4. Videre kan kombinasjon av Temozolomide og Lomustin øke median total overlevelse hos pasienter med O-6-metylguanin-metyltransferase (MGMT)-promotert metylering5. Til tross for disse nylige terapeutiske tilnærmingene forblir GBM imidlertid en uhelbredelig sykdom med dårlig prognose, preget av pasientens median totale overlevelsesrate på 16 måneder opp til 20,9 måneder når tumorbehandlingsfelt (TTFields) legges til 3,6. Flere immunterapeutiske tilnærminger har blitt undersøkt i GBM, men vist begrenset effekt in vivo. Videre hindrer kliniske og prekliniske begrensninger terapeutiske gjennombrudd7. Etableringen av en egnet og realistisk ex vivo-modell har vært utfordrende på grunn av inter-8 og intratumoral9 heterogenitet av GBM.
Konvensjonelle 2-dimensjonale (2D) pasientcellelinjer representerer homogene cellepopulasjoner og er egnet for legemiddelscreening med høy gjennomstrømning. Imidlertid klarer ikke pasientavledede og immortaliserte cellelinjer å etterligne GBM tilstrekkelig på grunn av forskjeller i vekstbetingelser og avvik i genotypiske og fenotypiske egenskaper etter flere passasjer 10,11,12.
På den annen side har 3D-organoidmodeller nylig dukket opp som lovende systemer som replikerer fenotypisk og molekylær heterogenitet av organ og forskjellige krefttyper 13,14,15,16,17,18. I sammenheng med GBM har cerebrale organoider blitt genetisk modifisert for å simulere tumorlignende egenskaper16,17 eller co-dyrket med GSCs eller sfæroider for å indusere tumorcelleinfiltrasjon18,19. Mens pasientavledede GBM-organoider dyrket med Matrigel og EGF / bFGF viser GBM-kjennetegn som stamcelleheterogenitet og hypoksi20, er det fortsatt usikkert i hvilken grad denne modellen kan representere de viktigste molekylære egenskapene til pasientens neoplasmer.
Pasientavledede GBM-organoider (PUD) er lovende modeller som kan opprettholde de dominerende egenskapene til deres analoge foreldretumorer, inkludert histologiske egenskaper, cellulært mangfold, genuttrykk og mutasjonsprofiler. I tillegg blir de raskt infiltrert ved implantasjon i voksne gnagerhjerner, noe som gir en realistisk modell for narkotikatesting og personlig terapi21. Imidlertid er manuell dissekering av tumorvev for å generere PUD tidkrevende og kostbart. Derfor er det et presserende behov for en rask metode som kan produsere et stort antall PUDer, noe som muliggjør omfattende vurdering av ulike terapeutiske tilnærminger som holder løfte om individualisert narkotikatesting. Denne studien beskriver en ny metode for fremstilling av PUD direkte fra nydissekert tumorvev ved hjelp av automatisk vevshakker. Videre ble PUD generert med denne metoden sammenlignet med manuelt dissekerte PUD fra de samme pasientene når det gjaldt PUD-tall, morfologiske egenskaper, apoptose og proliferasjon av tumorceller.
Denne studien presenterer en rask og effektiv metode for å generere PUD. GBM er fortsatt en utfordrende svulst å behandle, ofte preget av tilbakefall og høy sykdomsbyrde 3,6. Det er et presserende behov for innovative terapeutiske tilnærminger, da lovende resultater observert in vitro ofte ikke viser effekt in vivo under fase I-studier. En av årsakene til denne uoverensstemmelsen kan være den begrensede evnen til pasientavledede immortaliserte cellelinjer, dyrket i monolagskulturer, for å reflektere de komplekse cellecelleinteraksjonene og genetiske egenskapene til foreldretumoren. Gitt den høye inter- og intratumorale heterogeniteten til GBM 8,9, er personlige målrettede terapier foretrukket og kan holde løfte om fremtidige applikasjoner. I motsetning til 2D-adherente cellelinjer har organoider evnen til å beholde egenskapene til foreldrevevet21, men komplekse celle-celle-interaksjoner mellom svulsten og den normale hjernen er av avgjørende betydning og kan potensielt bli oversett av denne modellen. Manuell generering av PUD er imidlertid en tidkrevende prosess, og vevsskader forårsaket av klemming med skalpeller under skjæring kan hindre vellykket PUD-vekst. Derfor ble en automatisert metode optimalisert ved hjelp av et vevshakker for å generere høyere antall PUDer med redusert tid og krefter. I tillegg viste vi at den generelle sprednings- og apoptosefrekvensen ikke var forskjellig mellom de to tilnærmingene.
C-tilnærmingen er enkel, enkel å implementere og gjør det mulig å generere et større antall PUD-er (figur 3). Rotasjonen av vevet mellom andre og tredje runde med hakking ble identifisert som et kritisk trinn i protokollen. På dette stadiet har vevet allerede mistet sin integritet og kan lett falle fra hverandre, noe som resulterer i større stykker som krever ytterligere kutting eller manuell disseksjon under mikroskopet. Mens den automatiserte helikoptermetoden tillater en forhåndsinnstilt skjærestørrelse med større nøyaktighet, mangler den manuelle tilnærmingen presisjon for å bestemme størrelsen på PUD-er, noe som fører til ujevnt formede og store PUD-er, noe som er en ulempe for sammenlignende legemiddelscreening (figur 2). Likevel, med den foreslåtte metoden, oppnås ikke standardisering av celletall per PUD, noe som potensielt utgjør en ulempe for standardiserte legemiddelscreeningsprotokoller. Fordelene og ulempene ved forskjellige organoidgenereringsteknikker 18,19,20,24,25,26,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,
37,38,39,40,41,42 og deres søknader er oppsummert i tabell 3.
GBM-vev kan variere i konsistens, alt fra seig (infiltrasjonssone) til myk (nekrotisk kjerne), noe som kan utgjøre utfordringer for den automatiserte chopper-tilnærmingen. Hvis vevet er for tøft, kan hakkeren klemme og skade det, mens for bløtvev kan bli klemt. Det valgte vevet viste særegne egenskaper, inkludert et mellomliggende nivå av fasthet, sporadisk med en rosa-gråaktig farge i stedet for å manifestere brun eller gul misfarging. Vev med svampaktig og lett smuldrende tekstur viste overlegen konservering i agaroseblokkene, mens svært delikat og flytende tumorvev ble utelatt fra prøvetakingsprosedyren. Helikoptertilnærmingen muliggjorde imidlertid en vellykket generering av et høyere antall PUD-er sammenlignet med den manuelle tilnærmingen, selv med vev med suboptimal konsistens. Nøkkelløsningen er å opprettholde nært samspill med kirurgen som utfører tumorreseksjonen for å behandle vev fra forskjellige områder av svulsten. I tilfeller av suboptimal vevskonsistens var manuell omarbeiding av vevet under mikroskopet et nyttig tillegg etter hakking. For å ta hensyn til heterogenitet ble tumorvevet opprinnelig delt inn i seks segmenter, hver senere halvert for enten C- eller M-tilnærmingen. Innenfor disse seks distinkte seksjonene forventes en betydelig grad av heterogenitet. Videre, selv innenfor PUD fra samme seksjon eller brønn, er tilstedeværelsen av forskjellige delpopulasjoner plausibel.
Som bevis på konsept ble proliferasjons- og apoptosedata rapportert fra to pasienter med GBM og en pasient med LGG, som ikke viser noen signifikante forskjeller mellom de to metodene. Genereringen av PUD er ikke begrenset til svært ondartede hjernesvulster, men kan også brukes på LGG. Denne studien fremhever at LGG sjelden viser vekst i 2D-kultur, noe som gjør utviklingen av en nøyaktig modell for studien svært verdifull. Denne protokollen tar sikte på å demonstrere allsidigheten til denne tilnærmingen når det gjelder å generere PUDer fra GBM så vel som LGG raskt og effektivt.
Samlet sett kan PUD i fremtiden brukes til pasientorientert preterapeutisk testing av målrettede terapier i ondartede hjernesvulster. Å gi en rask og effektiv metode for individualisert legemiddelscreening er avgjørende, da tumorprogresjon skjer raskt, og bergingsbehandlingsalternativer er desperat nødvendig. Som et neste skritt kan PUD-modellen evalueres med ulike immunterapeutiske tilnærminger for bedre å etterligne reelle behandlingsresponser. I fremtiden kan PUD brukes til å trekke sofistikerte konklusjoner om behovet for videre utforskning og evaluering av terapier i en klinisk setting.
The authors have nothing to disclose.
Denne forskningen ble finansiert av Interdisciplinary Center of Clinical Research (IZKF, B-450) Würzburg, Bavarian Center of Cancer Research (BZKF) og publikasjonen støttet av Open Access Publishing Fund ved Universitetet i Würzburg. Vi takker Dagmar Hemmerich og Siglinde Kühnel, begge seksjon for eksperimentell nevrokirurgi, Nevrokirurgisk avdeling, Universitetssykehuset Würzburg, for teknisk støtte. Figur 1 er laget ved hjelp av www.biorender.com.
2-mercaptoethanol (1000x) | Gibco | 21985023 | |
30% formaldehyde methanol-free | Carl Roth | 4235.1 | Used in 4% concentration |
70% ethanol solution | For sterilisation | ||
Agarose tablets 0.5 g | Carl Roth | HP67.7 | |
Amphotericin B 250 µg/mL | Gibco | 15290018 | |
Anatomical forceps | Hartstein | N/A | |
Anatomical spatula | Hartstein | N/A | |
B-27 Supplement without vitamin A (50x) | Gibco | 12587010 | |
Biopsy cassette with cover | Resolab | 37001-b | |
Blades for McIlwain Tissue Chopper | Campden instruments | Model TC752-1 | |
CC3 antibody (Asp 175) | Cells signaling technology | 9661 | |
Disposable scalpel | Feather | 0200130015 | |
Distilled water | Gibco | 15230089 | To dilute the formaldehyd |
Dulbecco's Modified Eagle Serum Nutrient Mixture (DMEM) F-12 (1:1) (1x) | Gibco | 11330032 | Includes L-Glutamine and 15 mM HEPES |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (PBS) | Sigma Life Sciences | D8537-500ML | Modified, without calcium, chloride and magnesium chloride, liquid, sterile-filtered, suitable for cell culture |
eBioscience 1x RBC Lysis Buffer | Invitrogen | 433357 | |
Falcon tube 50 ml Cellstar | Greiner Bio-One | 227261 | |
GFAP antibody | Santa Cruz Biotechnology | sc33673 | |
Glass beaker | N/A | N/A | |
Glass petri dish | N/A | N/A | |
GlutaMAX (100x) | Gibco | 35050061 | |
Heracell 240i CO2 Incubator | Thermo scientific | 51032875 | |
Herasafe 2025 Biological Safety Cabinet | Thermo scientific | 5016643 | |
Hibernate-A | Gibco | A1247501 | |
Histoacryl glue | B. Braun surgical | 1050052 | |
Human Insulin, Solution | Santa Cruz Biotechnology | sc-360248 | |
Ice box | N/A | N/A | |
Ki67 antibody | Abcam | ab16667 | |
McIlwain Tissue Chopper | Cavey Laboratory Engineering | 51350V | |
Microscope Leica DMI 3000B, DMI 4000B, DMI 6000B | Leica | DMI6000B | For brightfield and immunofluorescence pictures |
Microscope stereozoom S9D | Leica | W841832 | For manual cutting and to organoids monitoring |
Microwave | Bosch | N/A | To heat the agarose solution |
Mounting plastic discs | Cavey Laboratory Engineering | 51354 | |
N-2 Supplement (100x) | Gibco | 17502048 | |
NEM Non-Essential Amino Acids (NEAA) (100x) | Gibco | 11140050 | |
Neurobasal (1x) | Gibco | 21103049 | |
Orbital shaking machine Rotamax120 | Heidolph | 10304491 | |
Penicilin Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
Plastic petri dishes Cellstar | greiner bio-one | 628160 | n = 12 |
Single channel pipette 1000 µm | Eppendorf | 4924000010 | |
Single channel pipette 5000 µm | Eppendorf | EP3123000276 | |
Statistical Package for the Social Sciences (SPSS) version 23.0 | IBM | ||
Surgipath Paraplast | Leica | 39601006 | Embedding medium |
Ultra-low attachment Nucleon Sphera 6-well plate | Thermo Scientific | 174932 |