Summary

Kanser Hücreleri ve Sitokinlere Yanıt Olarak İki Empedans Tabanlı Biyosensör ile Beyin Endotel Bariyer Bütünlüğündeki Değişikliklerin Ölçülmesi

Published: September 22, 2023
doi:

Summary

Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.

Abstract

Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin parankimini kandaki zararlı patojenlere karşı korur. BBB, perisitler, astrositik ayak süreçleri ve sıkıca yapışmış endotel hücrelerinden oluşan nörovasküler üniteden oluşur. Burada, beyin endotel hücreleri kan yoluyla bulaşan patojenlere karşı ilk bariyer hattını oluşturur. Kanser ve nöroinflamasyon gibi durumlarda, kandaki dolaşım faktörleri bu bariyeri bozabilir. Hastalığın ilerlemesi, beynin bölgelerine erişime veya bu bölgelerin bozulmasına izin veren bariyer bozulması sonrası önemli ölçüde kötüleşir. Bu, özellikle beyin düzeyinde mevcut olan sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozları önemli ölçüde kötüleştirir. Bu nedenle, ortaya çıkan çalışmalar, kandaki bu zararlı faktörlerin beyin endotel hücreleri ile etkileşime girmesini önleyebilecek potansiyel terapötikleri araştırmayı amaçlamaktadır.

Ticari olarak temin edilebilen Elektrik Hücresi-Substrat Empedans Algılama (ECIS) ve cellZscope cihazları, bariyer güçlerini belirlemek için BBB endotel gibi hücresel tek tabakalar boyunca empedansı ölçer. Burada, çeşitli uyaranların eklenmesi üzerine beyin endotel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesinde her iki biyosensörün kullanımını detaylandırıyoruz. En önemlisi, birden fazla değişkenin ve biyolojik arıtmanın eşzamanlı olarak araştırılması için yüksek verimli yeteneklerinin önemini vurguluyoruz.

Introduction

Bu makale, mikrovasküler hücrelerin değerlendirilmesindeki güncel eğilimleri tartışmaktadır. Serebral mikrovasküler endotel hücrelerinin bariyer özelliklerini ölçmek için ticari olarak mevcut iki platformun kullanımını özellikle detaylandırıyoruz. Endotel hücreleri, damar duvarını kaplayan kana bakan hücrelerdir. Bununla birlikte, serebral mikro damarlar, koruyucu kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturmaya yardımcı oldukları için benzersizdir1,2,3. BBB, moleküllerin kandan beyne taşınmasını düzenlemek için işlev görür. Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen periferik hastalıklar genellikle BBB 4,5’in fonksiyonel başarısızlığı ile bağlantılıdır. BBB’yi oluşturan anatomik yapılar, vücudun başka bir yerindeki kan-doku arayüzünde bulunmaz6. Bu anatomik yapılar, beyin endotel hücrelerine yakın bulunan ve çoğalmalarını ve geçirgenliklerini düzenleyen perisitleri içerir; besin karıştırma ve anatomik destek ile ilgili olan astrositik ayak süreçleri 7,8; Beyindeki yerleşik makrofajlar olan mikroglia, genellikle nöroinflamasyon ve iskemi 9,10,11,12 ve fenestrasyonlar olmadan sıkıca yapışmış hücrelerden oluşan bir tek tabaka oluşturan beyin endotelyumu 13,14. Beyin endoteli tipik olarak ‘beyin endotel bariyeri’ olarak bilinir ve beş farklı şekilde yapısal ve fonksiyonel bir bariyer oluşturur. İlk olarak, paraselüler bariyer bileşeni, lateral hücre-hücre bağlantılarında yapışma ile oluşturulur. İkincisi, transselüler bariyer bileşeni, endositozun düzenlenmesiyle sürdürülür. Üçüncüsü, özel bir bazal membran, büyük ölçüde kollajen15,16 içeren zengin bir hücre dışı matris aracılığıyla endotelyumu sabitler ve destekler. Son iki mekanizma, sırasıyla ilaçların metabolizmasını ve büyük moleküllerin alımını düzenlemeye yardımcı olan enzimler ve taşıyıcılar aracılığıyladır17.

Paraselüler etkileşimler, zar proteinleri claudins, okkludin ve eklem adezyon moleküllerini (JAM’ler) içeren sıkı bağlantılar (TJ’ler) tarafından kolaylaştırılan beyin endotel bariyerinin ana bileşenini oluşturur18. Membran proteinlerinin güçlü homotipik bağlanması ilk yapısal bariyeri oluşturur, ancak JAM’ler ayrıca aksesuar proteinler zonula okcludens’e bağlanır, böylece TJ’leri aktin hücre iskeletine19,20 bağlar. Aktin bağlantıları, TJ’leri endotel21’in apikal bölgesine yerleştirir, bu da endotel hücrelerini bu apikal veya “kanla yüz yüze” tarafta yapısal bariyer oluşturmak için işlevsel olarak polarize eder. Endotelin bazolateral bölgesinde, oldukça özelleşmiş adherens bağlantıları (AJ’ler) hücre morfolojisinin korunmasında düzenleyici bir rol oynar. AJ’ler, komşu endotel hücrelerinin hücre iskeletini katenin ailesi kompleksi20,22 aracılığıyla birbirine bağlayan kalsiyuma bağımlı kaderinleri içerir. Vasküler endotelyal kaderin (VE-Cadherin), endotelyal tek tabaka bütünlüğünü korumak için TJ proteinlerinin ekspresyonunu ve genel endotel bariyeri fonksiyonunu düzenleyen böyle bir kaderindir 23,24,25,26,27. Tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa) gibi inflamatuar modülatörler, VE-kaderin içselleştirilmesini hücre bağlantılarından uzaklaştırarak endotel bariyerinin 28,29,30 dengesizleşmesine yol açar. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü (PECAM)31, endotel bağlantılarını32,33 stabilize eden ve yeniden şekillendiren başka bir AJ kaderindir. Bu bağlantı proteinlerinin yoğunluğu, endotel hücreleri arasındaki paraselüler boşluktan elektron akışını kısıtlar. Bu özellik, beyin endotelyumu gibi birleşik hücre tek katmanları boyunca endotel bariyer kuvvetini veya trans-endotelyal elektrik direncini (TER) ölçmek için kullanılır.

Terapötik çalışmalar, kan-beyin arayüzündeki hayati rolü nedeniyle beyin endotelyumuna odaklanmaktadır. Multipl skleroz, felç, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi nöroinflamatuar durumlar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar beyin endotelini olumsuz etkiler 34,35,36,37. Beyin endotel bariyeri bozulduğunda, beyin kandaki zararlı uyaranlara etkili bir şekilde maruz kaldığından hastalığın ilerlemesi önemli ölçüde kötüleşir38. Daha önce inflamatuar mediatörlerin ve metastatik melanom hücrelerinin, endotel bariyer gücünü ölçen iki teknoloji kullanarak beyin endotel bariyerini bozduğunu göstermiştik 39,40,41.

Elektrik hücresi-substrat empedans algılama (ECIS), endotel hücre bariyeri bütünlüğünün gerçek zamanlı ve etiketsiz değerlendirmesine izin veren empedans tabanlı bir biyosensördür. Burada, tahlil kuyuları, tahlil sistemine alternatif akım (AC) getiren altın kaplama elektrotlarla kaplanmıştır. Beyin endotel hücreleri bu kuyucuklara ekilir, bu da AC’nin hücreler aracılığıyla uygulanabileceği anlamına gelir. (Şekil 1A-kuyu; yandan görünüm). Bu, empedansı hesaplamak için kullanılan elektrik devresini kurar (Şekil 1A-devre şeması). Beyin endotel hücreleri plakaya yapıştığında ve paraselüler bağlantılarını oluşturmaya başladığında empedans artar. Endotel hücreleri birleştiğinde, tek tabaka oluşturduğunda ve akım akışını kısıtladığında empedans platoları oluşur. AC’nin farklı frekanslarda uygulanması, endotel hücrelerinden geçen akım akış yolunu etkiler. Akım, daha yüksek bir frekansta (>10,4 Hz) uygulandığında endotel hücre gövdesinden akar. Bu, hücre bağlanmasını ve yayılmasını değerlendirmek için kullanılan hücre tek tabakasının kapasitansı hakkında bilgi sağlar. Düşük frekanslarda (102-10 4 Hz) membran empedansı yüksektir ve hücrelerden akım akışını kısıtlar. Bu durumda, akımın çoğunluğu hücreler arasında dolaşır. Yaklaşık 4.000 Hz’de, akım akışına karşı direnç, çoğunlukla hücreler arası boşluk yoluyla endotel hücre-hücre bağlantılarına atfedilir. Bu nedenle, bu frekansta dirençteki herhangi bir değişiklik, endotel bariyer bütünlüğü hakkında bilgi sağlar.

Ham empedans ölçümleri bariyer özellikleri hakkında bilgi sağlayabilirken, ECIS yazılımı daha sonra birden fazla AC frekansında ölçülen toplam direnci matematiksel olarak modelleyebilir ve daha kesin bir şekilde bariyer bütünlüğünün iki temel parametresine ayırabilir. Bu parametreler, komşu hücrelerin lateral zarları arasındaki parasellüler dirençtir (direnç beta-Rb; paraselüler bariyer; Şekil 1A-yeşil oklar) ve bazal hücre tabakası ile elektrot arasındaki bazolateral direnç (direnç alfa-Alfa; bazolateral bariyer; Şekil 1A-mavi oklar). Modellenen üçüncü bir parametre de hücre zarı kapasitansı (Cm; Şekil 1A-kırmızı oklar). CM, hücre zarı bileşiminin göstergesi olan hücrelerden geçen akımın kapasitif akışını gösterir. Burada, Rb veya parasellüler bariyerdeki değişiklikler, endotel bariyer bütünlüğünün korunmasında çok önemli olan TJ’ler ve AJ’lerdeki değişiklikleri gösterir. Rb’yi güvenilir bir şekilde yorumlamak için, Giaever ve Keese42 tarafından geliştirilen ve Stolwijk ve ark.43 tarafından eleştirel olarak tartışılan dört temel varsayım yapılmıştır. Bu varsayımlar, ECIS modellemesinin geçerliliğini sağlamak için önemli olsa da, birleşik bir endotelyal tek tabaka tarafından kolayca karşılanırlar.

ECIS gibi, cellZscope da endotel bariyer direncindeki değişikliklerin ölçülmesine izin verir; Bununla birlikte, hücreler gözenekli bir zar eki üzerinde kültürlenir. Bu sistemde, elektrik devresi bir membran ekinin her iki tarafındaki iki elektrot arasındadır. Endotelyal tek tabaka, trans-endotelyal elektrik direncinin (TER) ölçülmesine izin verecek şekilde bu membran ekinin üzerinde kültürlenir (Şekil 1B-kuyu; yandan görünüm). ECIS’te olduğu gibi, bu sistemde toplam empedans, uygulanan akımınfrekansına bağlı olarak birkaç bariyer bileşenine bağlanabilir 44. Düşük frekanslarda, elektrot kapasitansı (CEl) sistemin toplam empedansına hakimdir. Alternatif olarak, yüksek frekanslarda, ortamın direnci (Rortamı) toplam empedansa hakimdir. Bu nedenle, en kullanışlı ölçümler, endotel bariyerinin iki temel bileşeni hakkında bilgi sağlayan orta frekans aralığına (102-10 4 Hz) girer (Şekil 1B-devre şeması). İlk olarak, 103-10 4 Hz’de, hücre tabakası kapasitansı (CCl), membran direnci (Rzarı) ihmal edilecek kadar yüksek olduğundan ve akım ağırlıklı olarak kapasitör boyunca aktığından genel empedansa hakimdir. Bu nedenle, CCl , hücre zarı boyunca dirençteki değişiklikleri gösterir. Alternatif olarak, TER ağırlıklı olarak genel empedansı 102-10 3 Hz’de verir, burada akım akışı, bağlantı proteinleri tarafından bir arada tutulan komşu hücreler arasındaki bağlantı boşluklarından kanalize edilir. Bu nedenle, bu, daha önce ECIS’te Rb ile görüldüğü gibi, endotel bariyerinin parasellüler bileşeni hakkında bilgi sağlar.

Şekil 1C, beyin endotelinin belirli bölgelerinin melanom hücreleri ile tedavi ile nasıl bozulduğunu detaylandırmaktadır. Bu bozulma, biyosensörler tarafından paraselüler boşluktan geçen akım akışındaki bir değişiklikle (Rb veya TER olarak ölçülür) tespit edilir; bazolateral boşluk (Alfa olarak ölçülür); ve hücre zarı (C, m veya C, Cl olarak ölçülür). Sitokinler veya invaziv melanom hücreleri gibi çeşitli uyaranlarla tedaviyi takiben beyin endotel bariyeri değişimini ölçmek için bu girişte ayrıntıları verilen her iki biyosensörü de kullandık. Belirli bir uyaran endotel bariyerini bozarsa ölçülen direnç azalır ve akım akışına izin vermek için en az dirençli bir yol oluşturur. Bu nedenle, “bariyer direncindeki” bir azalma, bariyer bütünlüğünün kaybını veya beyin endotel bariyerinin bozulmasını gösterir. Bu tahlillerde, direnci ve modellenmiş parametreleri gerçek zamanlı olarak yorumlayarak bu bozulmayı inceledik. ECIS ve cellZscope’un bu tür araştırma sorularının ele alınmasındaki uygulamasıbaşka bir yerde detaylandırılmıştır 39,41,45,46.

İn vitro araştırmalar, hastalığı ilerleten molekülleri ve fonksiyonel yolları ortaya çıkararak önemli hastalık mekanizmalarının keşfedilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu, işleyen bir vücuttan önemli ölçüde farklı olan in vitro olarak hastalığın güvenilir bir şekilde tekrarlanmasını gerektirir. İdeal bir senaryoda, in vitro araştırma tekrarlanabilir, non-invaziv, etiketsiz, nicel olmalı ve in vivo bulunan yapısal etkileri taklit etmelidir. Bu makalede, beyin endotel bariyeri bütünlüğünde tedaviye bağlı değişiklikleri ölçmek için bu iki rakip teknolojiyi kullanma metodolojisini detaylandırıyoruz. Engellerin bozulmasının daha kapsamlı bir resmini sağlamak için sonuçlarını birleştirmenin avantajlarını tartışıyor ve hala üstesinden gelinmesi gereken sınırlamaları paylaşıyoruz.

Protocol

1. Çeşitli tedavilere yanıt olarak beyin endotel bariyeri bütünlüğündeki değişiklikleri izlemek için ECIS’i kullanma Yazılımın, dizi istasyonunun ve makinenin kurulması96 kuyulu dizi istasyonunu makineye bağlayın. Dizi istasyonunu plastik bir torbaya koyun ve ısınmasını sağlamak için testten en az 1 saat önce inkübatöre yerleştirin. Deneyden hemen önce plastik torbayı çıkarın. Hazır olduğunuzda, makineyi açın ve ilgili yazılımı bi…

Representative Results

ECIS empedans verilerinin yorumlanması Optimal deney koşullarını anlamaBurada, veriler yazılım kullanılarak doğrudan görüntülenebilir (Şekil 2A) veya analiz ve grafik çizimi için dışa aktarılabilir (Şekil 2B). Şekil 2A , gerçek yazılım arayüzünde görüntülenen verilerin bir örneğini göstermektedir. Soldaki grafik, 96 oyuklu biyosens…

Discussion

BBB’yi etkileyen hastalıklar üzerine yapılan terapötik çalışmalar, beyin endotel bariyer bütünlüğünün ve regülasyonunun önemini göz önünde bulundurmalıdır. Örneğin, kanserin diğer anatomik bölgelerden beyne metastaz yapmasında beyin endotel bariyerinin bozulması kritik olarak araştırılmaktadır. Bunun nedeni, beyin endotelinin dolaşımdaki tümör hücrelerine karşı ilk bariyeri oluşturmasıdır. Giriş bölümünde daha önce de belirtildiği gibi, endotel bariyer bütünlüğü ile ilgi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Akshata Anchan, Yeni Zelanda Nöroloji Vakfı tarafından Gillespie Bursu (hibe referansı: 1628-GS) ve İlk Burs (hibe referansı: 2021 FFE) için finanse edildi. Araştırma maliyeti ayrıca kısmen Nöroloji Vakfı Bursu-2021 FFE ve Auckland Üniversitesi Fakülte Araştırma Geliştirme Fonu tarafından finanse edildi. James Hucklesby, Auckland Tıbbi Araştırma Vakfı’ndan bir bursla finanse edildi. Baguley ekibine ve Auckland Kanser Derneği Araştırma Merkezi’ne hasta kaynaklı Yeni Zelanda Melanom NZM hücre hatları için teşekkürler.

Materials

aMEM Gibco 12561072 Melanoma cell base media
cellZscope array nanoAnalytics cellZscope2; software v4.3.1 TER measuring biosensor array
Collagen I—rat tail Gibco A1048301 ECM substrate for coating
dibutyryl-cAMP Sigma-Aldrich D0627 Brain endothelial media supplement
ECIS array  Applied Biophysics ECIS ZΘ; software v1.2.163.0 Rb/Alpha measuring biosensor array
ECIS plate  Applied Biophysics 96W20idf  96-well biosensor plate
FBS Sigma-Aldrich 12203C-500ML
GlutaMAX Gibco 305050-061 Brain endothelial media supplement
hCMVEC Applied Biological Materials T0259 Brain endothelial cell line
hEGF PeproTech PTAF10015100 Brain endothelial media supplement
Heparin Sigma-Aldrich H-3393 Brain endothelial media supplement
hFGF PeproTech PTAF10018B50 Brain endothelial media supplement
Hydrocortison Sigma-Aldrich H0888 Brain endothelial media supplement
IL-1β PeproTech 200-01B Cytokine
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite Sigma-Aldrich 11074547001 Melanoma cell media supplement
M199 Gibco 11150-067 Brain endothelial cell base media
MilliQ water Deionized water
PBS 1x Gibco 10010-023
TNFα PeproTech 300-01A Cytokine
Transwell insert Corning CLS3464 Porous membrane insert
TrypLE Express Enzyme Gibco 12604021 Dissociation reagent

References

  1. Fidler, I. J., Schackert, G., Zhang, R. D., Radinsky, R., Fujimaki, T. The biology of melanoma brain metastasis. Cancer Metastasis Reviews. 18 (3), 387-400 (1999).
  2. Tomlinson, E. Theory and practice of site-specific drug delivery. Advanced Drug Delivery Reviews. 1 (2), 87-198 (1987).
  3. Abbott, N. J., Patabendige, A. K., Dolman, D. E. M., Yusof, S. R., Begley, D. J. Structure and function of the blood-brain barrier. Neurobiology of Disease. 37 (1), 13-25 (2010).
  4. Neuwelt, E., et al. Strategies to advance translational research into brain barriers. The Lancet. Neurology. 7 (1), 84-96 (2008).
  5. Stolp, H. B., Dziegielewska, K. M. Review: Role of developmental inflammation and blood-brain barrier dysfunction in neurodevelopmental and neurodegenerative diseases. Neuropathology and Applied Neurobiology. 35 (2), 132-146 (2009).
  6. Gastfriend, B. D., Palecek, S. P., Shusta, E. V. Modeling the blood-brain barrier: Beyond the endothelial cells. Current Opinion in Biomedical Engineering. 5, 6-12 (2018).
  7. Kacem, K., Lacombe, P., Seylaz, J., Bonvento, G. Structural organization of the perivascular astrocyte endfeet and their relationship with the endothelial glucose transporter: A confocal microscopy study. Glia. 23 (1), 1-10 (1998).
  8. Abbott, N. J., Ronnback, L., Hansson, E. Astrocyte-endothelial interactions at the blood-brain barrier. Nature Reviews. Neuroscience. 7 (1), 41-53 (2006).
  9. Hickey, W. F., Kimura, H. Perivascular microglial cells of the cns are bone marrow-derived and present antigen in vivo. Science. 239 (4837), 290-292 (1988).
  10. Smith, J. A., Das, A., Ray, S. K., Banik, N. L. Role of pro-inflammatory cytokines released from microglia in neurodegenerative diseases. Brain Research Bulletin. 87 (1), 10-20 (2012).
  11. Denes, A., et al. Proliferating resident microglia after focal cerebral ischaemia in mice. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 27 (12), 1941-1953 (2007).
  12. Nishioku, T., et al. Detachment of brain pericytes from the basal lamina is involved in disruption of the blood-brain barrier caused by lipopolysaccharide-induced sepsis in mice. Celular andl Molecular Neurobiology. 29 (3), 309-316 (2009).
  13. Felgenhauer, K. The blood-brain barrier redefined. Journal of Neurology. 233 (4), 193-194 (1986).
  14. Scheinberg, L. C., Edelman, F. L., Levy, W. A. Is the brain "an immunologically privileged site"?I. Studies based on intracerebral tumor homotransplantation and isotransplantation to sensitized hosts. Archives of Neurology. 11, 248-264 (1964).
  15. Carbonell, W. S., Ansorge, O., Sibson, N., Muschel, R. The vascular basement membrane as "soil" in brain metastasis. PLoS One. 4 (6), e5857 (2009).
  16. Nag, S. Morphology and molecular properties of cellular components of normal cerebral vessels. Methods in Molecular Medicine. 89, 3-36 (2003).
  17. Wilhelm, I., Fazakas, C., Krizbai, I. A. In vitro models of the blood-brain barrier. Acta Neurobiologiae Experimentalis. 71 (1), 113-128 (2011).
  18. Bauer, H. C., et al. New aspects of the molecular constituents of tissue barriers. Journal of Neural Transmission (Vienna). 118 (1), 7-21 (2011).
  19. Balda, M. S., Matter, K. Tight junctions as regulators of tissue remodelling. Current Opinion in Cell Biology. 42, 94-101 (2016).
  20. Ballabh, P., Braun, A., Nedergaard, M. The blood-brain barrier: An overview: Structure, regulation, and clinical implications. Neurobiology of Disease. 16 (1), 1-13 (2004).
  21. Van Itallie, C. M., Tietgens, A. J., Anderson, J. M. Visualizing the dynamic coupling of claudin strands to the actin cytoskeleton through zo-1. Molecular Biology of the Cell. 28 (4), 524-534 (2017).
  22. Takeichi, M. Historical review of the discovery of cadherin, in memory of tokindo okada. Development, Growth & Differentiation. 60 (1), 3-13 (2018).
  23. Vincent, P. A., Xiao, K., Buckley, K. M., Kowalczyk, A. P. Ve-cadherin: Adhesion at arm’s length. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 286 (5), C987-C997 (2004).
  24. Brasch, J., et al. Structure and binding mechanism of vascular endothelial cadherin: A divergent classical cadherin. Journal of Molecular Biology. 408 (1), 57-73 (2011).
  25. Gavard, J., Patel, V., Gutkind, J. S. Angiopoietin-1 prevents vegf-induced endothelial permeability by sequestering src through mdia. Developmental Cell. 14 (1), 25-36 (2008).
  26. Romero, I. A., et al. Changes in cytoskeletal and tight junctional proteins correlate with decreased permeability induced by dexamethasone in cultured rat brain endothelial cells. Neuroscience Letters. 344 (2), 112-116 (2003).
  27. Aragon-Sanabria, V., et al. Ve-cadherin disassembly and cell contractility in the endothelium are necessary for barrier disruption induced by tumor cells. Scientific Reports. 7, 45835 (2017).
  28. Angelini, D. J., et al. Tnf-alpha increases tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and opens the paracellular pathway through fyn activation in human lung endothelia. American Journal of Physiology. Lung Cellular and Molecular Physiology. 291 (6), L1232-L1245 (2006).
  29. Nwariaku, F. E., et al. Tyrosine phosphorylation of vascular endothelial cadherin and the regulation of microvascular permeability. Surgery. 132 (2), 180-185 (2002).
  30. Orsenigo, F., et al. Phosphorylation of ve-cadherin is modulated by haemodynamic forces and contributes to the regulation of vascular permeability in vivo. Nature Communications. 3, 1208 (2012).
  31. Weksler, B. B., et al. Blood-brain barrier-specific properties of a human adult brain endothelial cell line. FASEB Journal. 19 (13), 1872-1874 (2005).
  32. Chen, Z., Tzima, E. Pecam-1 is necessary for flow-induced vascular remodeling. Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology. 29 (7), 1067-1073 (2009).
  33. Privratsky, J. R., Newman, P. J. Pecam-1: Regulator of endothelial junctional integrity. Cell and Tissue Research. 355 (3), 607-619 (2014).
  34. Abdullahi, W., Tripathi, D., Ronaldson, P. T. Blood-brain barrier dysfunction in ischemic stroke: Targeting tight junctions and transporters for vascular protection. American Journal of Physiology. Cell Physiology. 315 (3), C343-C356 (2018).
  35. Bernardo-Castro, S., et al. Pathophysiology of blood-brain barrier permeability throughout the different stages of ischemic stroke and its implication on hemorrhagic transformation and recovery. Frontiers in Neurology. 11, 594672 (2020).
  36. Wilhelm, I., Molnár, J., Fazakas, C., Haskó, J., Krizbai, I. A. Role of the blood-brain barrier in the formation of brain metastases. International Journal of Molecular Sciences. 14 (1), 1383-1411 (2013).
  37. Yuan, Y., Sun, J., Dong, Q., Cui, M. Blood-brain barrier endothelial cells in neurodegenerative diseases: Signals from the "barrier". Frontiers in Neuroscience. 17, 1047778 (2023).
  38. Abate-Daga, D., Ramello, M. C., Smalley, I., Forsyth, P. A., Smalley, K. S. M. The biology and therapeutic management of melanoma brain metastases. Biochemistry & Pharmacology. 153, 35-45 (2018).
  39. Anchan, A., et al. Real-time measurement of melanoma cell-mediated human brain endothelial barrier disruption using electric cell-substrate impedance sensing technology. Biosensors (Basel). 9 (2), (2019).
  40. Anchan, A., et al. Analysis of melanoma secretome for factors that directly disrupt the barrier integrity of brain endothelial cells. International Journal of Molecular Sciences. 21 (21), 8193 (2020).
  41. Hucklesby, J. J. W., et al. Comparison of leading biosensor technologies to detect changes in human endothelial barrier properties in response to pro-inflammatory tnfα and il1β in real-time. Biosensors (Basel). 11 (5), 159 (2021).
  42. Giaever, I., Keese, C. R. Micromotion of mammalian cells measured electrically. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 88 (17), 7896 (1991).
  43. Stolwijk, J. A., Matrougui, K., Renken, C. W., Trebak, M. Impedance analysis of gpcr-mediated changes in endothelial barrier function: Overview and fundamental considerations for stable and reproducible measurements. Pflugers Archive: European Journal of Physiology. 467 (10), 2193-2218 (2015).
  44. Benson, K., Cramer, S., Galla, H. -. J. Impedance-based cell monitoring: Barrier properties and beyond. Fluids Barriers CNS. 10 (1), 5 (2013).
  45. Anchan, A., Finlay, G., Angel, C. E., Hucklesby, J. J. W., Graham, S. E. Melanoma mediated disruption of brain endothelial barrier integrity is not prevented by the inhibition of matrix metalloproteinases and proteases. Biosensors (Basel). 12 (8), 660 (2022).
  46. Robilliard, L. D., et al. The importance of multifrequency impedance sensing of endothelial barrier formation using ecis technology for the generation of a strong and durable paracellular barrier. Biosensors. 8 (3), 64 (2018).
  47. Giavazzi, R., Foppolo, M., Dossi, R., Remuzzi, A. Rolling and adhesion of human tumor cells on vascular endothelium under physiological flow conditions. The Journal of Clinical Investigation. 92 (6), 3038-3044 (1993).
  48. Qi, J., Chen, N., Wang, J., Siu, C. H. Transendothelial migration of melanoma cells involves n-cadherin-mediated adhesion and activation of the beta-catenin signaling pathway. Molecular Biology of the Cell. 16 (9), 4386-4397 (2005).
  49. Brayton, J., Qing, Z., Hart, M. N., Vangilder, J. C., Fabry, Z. Influence of adhesion molecule expression by human brain microvessel endothelium on cancer cell adhesion. Journal of Neuroimmunology. 89 (1-2), 104-112 (1998).
  50. Soto, M. S., Serres, S., Anthony, D. C., Sibson, N. R. Functional role of endothelial adhesion molecules in the early stages of brain metastasis. Neuro-oncology. 16 (4), 540-551 (2014).
  51. García-Martín, A. B., et al. Vla-4 mediated adhesion of melanoma cells on the blood-brain barrier is the critical cue for melanoma cell intercalation and barrier disruption. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 39 (10), 1995-2010 (2018).
  52. Worzfeld, T., Schwaninger, M. Apicobasal polarity of brain endothelial cells. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 36 (2), 340-362 (2016).
  53. Stone, N. L., England, T. J., O’sulli, S. E. A novel transwell blood brain barrier model using primary human cells. Frontiers in Cellular Neuroscience. 13, 230 (2019).
  54. . Abstracts from the international symposium "signal transduction at the blood-brain barriers&#34 2022. Fluids and Barriers of the CNS. 20 (1), 26 (2023).
  55. Srinivasan, B., et al. Teer measurement techniques for in vitro barrier model systems. SLAS Technology. 20 (2), 107-126 (2015).

Play Video

Cite This Article
Anchan, A., Hucklesby, J. J., Graham, E. S., Angel, C. E. Measuring Changes in Brain Endothelial Barrier Integrity with Two Impedance-based Biosensors in Response to Cancer Cells and Cytokines. J. Vis. Exp. (199), e65959, doi:10.3791/65959 (2023).

View Video