Burada empedans tabanlı biyosensörleri kullanma tekniğini gösteriyoruz: beyin endotel bariyer gücünü ölçmek için ECIS ve cellZscope. Beyin endotelinin in vitro modeline çeşitli uyaranlar eklemenin hazırlanmasını ve tekniğini detaylandırıyoruz. Bulguları ölçüyor, kaydediyor ve temsili bir analiz yapıyoruz.
Kan-beyin bariyeri (BBB), beyin parankimini kandaki zararlı patojenlere karşı korur. BBB, perisitler, astrositik ayak süreçleri ve sıkıca yapışmış endotel hücrelerinden oluşan nörovasküler üniteden oluşur. Burada, beyin endotel hücreleri kan yoluyla bulaşan patojenlere karşı ilk bariyer hattını oluşturur. Kanser ve nöroinflamasyon gibi durumlarda, kandaki dolaşım faktörleri bu bariyeri bozabilir. Hastalığın ilerlemesi, beynin bölgelerine erişime veya bu bölgelerin bozulmasına izin veren bariyer bozulması sonrası önemli ölçüde kötüleşir. Bu, özellikle beyin düzeyinde mevcut olan sınırlı tedavi seçenekleri nedeniyle prognozları önemli ölçüde kötüleştirir. Bu nedenle, ortaya çıkan çalışmalar, kandaki bu zararlı faktörlerin beyin endotel hücreleri ile etkileşime girmesini önleyebilecek potansiyel terapötikleri araştırmayı amaçlamaktadır.
Ticari olarak temin edilebilen Elektrik Hücresi-Substrat Empedans Algılama (ECIS) ve cellZscope cihazları, bariyer güçlerini belirlemek için BBB endotel gibi hücresel tek tabakalar boyunca empedansı ölçer. Burada, çeşitli uyaranların eklenmesi üzerine beyin endotel bariyer bütünlüğünün değerlendirilmesinde her iki biyosensörün kullanımını detaylandırıyoruz. En önemlisi, birden fazla değişkenin ve biyolojik arıtmanın eşzamanlı olarak araştırılması için yüksek verimli yeteneklerinin önemini vurguluyoruz.
Bu makale, mikrovasküler hücrelerin değerlendirilmesindeki güncel eğilimleri tartışmaktadır. Serebral mikrovasküler endotel hücrelerinin bariyer özelliklerini ölçmek için ticari olarak mevcut iki platformun kullanımını özellikle detaylandırıyoruz. Endotel hücreleri, damar duvarını kaplayan kana bakan hücrelerdir. Bununla birlikte, serebral mikro damarlar, koruyucu kan-beyin bariyerini (BBB) oluşturmaya yardımcı oldukları için benzersizdir1,2,3. BBB, moleküllerin kandan beyne taşınmasını düzenlemek için işlev görür. Merkezi sinir sistemini (CNS) etkileyen periferik hastalıklar genellikle BBB 4,5’in fonksiyonel başarısızlığı ile bağlantılıdır. BBB’yi oluşturan anatomik yapılar, vücudun başka bir yerindeki kan-doku arayüzünde bulunmaz6. Bu anatomik yapılar, beyin endotel hücrelerine yakın bulunan ve çoğalmalarını ve geçirgenliklerini düzenleyen perisitleri içerir; besin karıştırma ve anatomik destek ile ilgili olan astrositik ayak süreçleri 7,8; Beyindeki yerleşik makrofajlar olan mikroglia, genellikle nöroinflamasyon ve iskemi 9,10,11,12 ve fenestrasyonlar olmadan sıkıca yapışmış hücrelerden oluşan bir tek tabaka oluşturan beyin endotelyumu 13,14. Beyin endoteli tipik olarak ‘beyin endotel bariyeri’ olarak bilinir ve beş farklı şekilde yapısal ve fonksiyonel bir bariyer oluşturur. İlk olarak, paraselüler bariyer bileşeni, lateral hücre-hücre bağlantılarında yapışma ile oluşturulur. İkincisi, transselüler bariyer bileşeni, endositozun düzenlenmesiyle sürdürülür. Üçüncüsü, özel bir bazal membran, büyük ölçüde kollajen15,16 içeren zengin bir hücre dışı matris aracılığıyla endotelyumu sabitler ve destekler. Son iki mekanizma, sırasıyla ilaçların metabolizmasını ve büyük moleküllerin alımını düzenlemeye yardımcı olan enzimler ve taşıyıcılar aracılığıyladır17.
Paraselüler etkileşimler, zar proteinleri claudins, okkludin ve eklem adezyon moleküllerini (JAM’ler) içeren sıkı bağlantılar (TJ’ler) tarafından kolaylaştırılan beyin endotel bariyerinin ana bileşenini oluşturur18. Membran proteinlerinin güçlü homotipik bağlanması ilk yapısal bariyeri oluşturur, ancak JAM’ler ayrıca aksesuar proteinler zonula okcludens’e bağlanır, böylece TJ’leri aktin hücre iskeletine19,20 bağlar. Aktin bağlantıları, TJ’leri endotel21’in apikal bölgesine yerleştirir, bu da endotel hücrelerini bu apikal veya “kanla yüz yüze” tarafta yapısal bariyer oluşturmak için işlevsel olarak polarize eder. Endotelin bazolateral bölgesinde, oldukça özelleşmiş adherens bağlantıları (AJ’ler) hücre morfolojisinin korunmasında düzenleyici bir rol oynar. AJ’ler, komşu endotel hücrelerinin hücre iskeletini katenin ailesi kompleksi20,22 aracılığıyla birbirine bağlayan kalsiyuma bağımlı kaderinleri içerir. Vasküler endotelyal kaderin (VE-Cadherin), endotelyal tek tabaka bütünlüğünü korumak için TJ proteinlerinin ekspresyonunu ve genel endotel bariyeri fonksiyonunu düzenleyen böyle bir kaderindir 23,24,25,26,27. Tümör nekroz faktörü-alfa (TNFa) gibi inflamatuar modülatörler, VE-kaderin içselleştirilmesini hücre bağlantılarından uzaklaştırarak endotel bariyerinin 28,29,30 dengesizleşmesine yol açar. Trombosit endotel hücre adezyon molekülü (PECAM)31, endotel bağlantılarını32,33 stabilize eden ve yeniden şekillendiren başka bir AJ kaderindir. Bu bağlantı proteinlerinin yoğunluğu, endotel hücreleri arasındaki paraselüler boşluktan elektron akışını kısıtlar. Bu özellik, beyin endotelyumu gibi birleşik hücre tek katmanları boyunca endotel bariyer kuvvetini veya trans-endotelyal elektrik direncini (TER) ölçmek için kullanılır.
Terapötik çalışmalar, kan-beyin arayüzündeki hayati rolü nedeniyle beyin endotelyumuna odaklanmaktadır. Multipl skleroz, felç, nörodejeneratif hastalıklar ve kanser gibi nöroinflamatuar durumlar dahil olmak üzere çeşitli hastalıklar beyin endotelini olumsuz etkiler 34,35,36,37. Beyin endotel bariyeri bozulduğunda, beyin kandaki zararlı uyaranlara etkili bir şekilde maruz kaldığından hastalığın ilerlemesi önemli ölçüde kötüleşir38. Daha önce inflamatuar mediatörlerin ve metastatik melanom hücrelerinin, endotel bariyer gücünü ölçen iki teknoloji kullanarak beyin endotel bariyerini bozduğunu göstermiştik 39,40,41.
Elektrik hücresi-substrat empedans algılama (ECIS), endotel hücre bariyeri bütünlüğünün gerçek zamanlı ve etiketsiz değerlendirmesine izin veren empedans tabanlı bir biyosensördür. Burada, tahlil kuyuları, tahlil sistemine alternatif akım (AC) getiren altın kaplama elektrotlarla kaplanmıştır. Beyin endotel hücreleri bu kuyucuklara ekilir, bu da AC’nin hücreler aracılığıyla uygulanabileceği anlamına gelir. (Şekil 1A-kuyu; yandan görünüm). Bu, empedansı hesaplamak için kullanılan elektrik devresini kurar (Şekil 1A-devre şeması). Beyin endotel hücreleri plakaya yapıştığında ve paraselüler bağlantılarını oluşturmaya başladığında empedans artar. Endotel hücreleri birleştiğinde, tek tabaka oluşturduğunda ve akım akışını kısıtladığında empedans platoları oluşur. AC’nin farklı frekanslarda uygulanması, endotel hücrelerinden geçen akım akış yolunu etkiler. Akım, daha yüksek bir frekansta (>10,4 Hz) uygulandığında endotel hücre gövdesinden akar. Bu, hücre bağlanmasını ve yayılmasını değerlendirmek için kullanılan hücre tek tabakasının kapasitansı hakkında bilgi sağlar. Düşük frekanslarda (102-10 4 Hz) membran empedansı yüksektir ve hücrelerden akım akışını kısıtlar. Bu durumda, akımın çoğunluğu hücreler arasında dolaşır. Yaklaşık 4.000 Hz’de, akım akışına karşı direnç, çoğunlukla hücreler arası boşluk yoluyla endotel hücre-hücre bağlantılarına atfedilir. Bu nedenle, bu frekansta dirençteki herhangi bir değişiklik, endotel bariyer bütünlüğü hakkında bilgi sağlar.
Ham empedans ölçümleri bariyer özellikleri hakkında bilgi sağlayabilirken, ECIS yazılımı daha sonra birden fazla AC frekansında ölçülen toplam direnci matematiksel olarak modelleyebilir ve daha kesin bir şekilde bariyer bütünlüğünün iki temel parametresine ayırabilir. Bu parametreler, komşu hücrelerin lateral zarları arasındaki parasellüler dirençtir (direnç beta-Rb; paraselüler bariyer; Şekil 1A-yeşil oklar) ve bazal hücre tabakası ile elektrot arasındaki bazolateral direnç (direnç alfa-Alfa; bazolateral bariyer; Şekil 1A-mavi oklar). Modellenen üçüncü bir parametre de hücre zarı kapasitansı (Cm; Şekil 1A-kırmızı oklar). CM, hücre zarı bileşiminin göstergesi olan hücrelerden geçen akımın kapasitif akışını gösterir. Burada, Rb veya parasellüler bariyerdeki değişiklikler, endotel bariyer bütünlüğünün korunmasında çok önemli olan TJ’ler ve AJ’lerdeki değişiklikleri gösterir. Rb’yi güvenilir bir şekilde yorumlamak için, Giaever ve Keese42 tarafından geliştirilen ve Stolwijk ve ark.43 tarafından eleştirel olarak tartışılan dört temel varsayım yapılmıştır. Bu varsayımlar, ECIS modellemesinin geçerliliğini sağlamak için önemli olsa da, birleşik bir endotelyal tek tabaka tarafından kolayca karşılanırlar.
ECIS gibi, cellZscope da endotel bariyer direncindeki değişikliklerin ölçülmesine izin verir; Bununla birlikte, hücreler gözenekli bir zar eki üzerinde kültürlenir. Bu sistemde, elektrik devresi bir membran ekinin her iki tarafındaki iki elektrot arasındadır. Endotelyal tek tabaka, trans-endotelyal elektrik direncinin (TER) ölçülmesine izin verecek şekilde bu membran ekinin üzerinde kültürlenir (Şekil 1B-kuyu; yandan görünüm). ECIS’te olduğu gibi, bu sistemde toplam empedans, uygulanan akımınfrekansına bağlı olarak birkaç bariyer bileşenine bağlanabilir 44. Düşük frekanslarda, elektrot kapasitansı (CEl) sistemin toplam empedansına hakimdir. Alternatif olarak, yüksek frekanslarda, ortamın direnci (Rortamı) toplam empedansa hakimdir. Bu nedenle, en kullanışlı ölçümler, endotel bariyerinin iki temel bileşeni hakkında bilgi sağlayan orta frekans aralığına (102-10 4 Hz) girer (Şekil 1B-devre şeması). İlk olarak, 103-10 4 Hz’de, hücre tabakası kapasitansı (CCl), membran direnci (Rzarı) ihmal edilecek kadar yüksek olduğundan ve akım ağırlıklı olarak kapasitör boyunca aktığından genel empedansa hakimdir. Bu nedenle, CCl , hücre zarı boyunca dirençteki değişiklikleri gösterir. Alternatif olarak, TER ağırlıklı olarak genel empedansı 102-10 3 Hz’de verir, burada akım akışı, bağlantı proteinleri tarafından bir arada tutulan komşu hücreler arasındaki bağlantı boşluklarından kanalize edilir. Bu nedenle, bu, daha önce ECIS’te Rb ile görüldüğü gibi, endotel bariyerinin parasellüler bileşeni hakkında bilgi sağlar.
Şekil 1C, beyin endotelinin belirli bölgelerinin melanom hücreleri ile tedavi ile nasıl bozulduğunu detaylandırmaktadır. Bu bozulma, biyosensörler tarafından paraselüler boşluktan geçen akım akışındaki bir değişiklikle (Rb veya TER olarak ölçülür) tespit edilir; bazolateral boşluk (Alfa olarak ölçülür); ve hücre zarı (C, m veya C, Cl olarak ölçülür). Sitokinler veya invaziv melanom hücreleri gibi çeşitli uyaranlarla tedaviyi takiben beyin endotel bariyeri değişimini ölçmek için bu girişte ayrıntıları verilen her iki biyosensörü de kullandık. Belirli bir uyaran endotel bariyerini bozarsa ölçülen direnç azalır ve akım akışına izin vermek için en az dirençli bir yol oluşturur. Bu nedenle, “bariyer direncindeki” bir azalma, bariyer bütünlüğünün kaybını veya beyin endotel bariyerinin bozulmasını gösterir. Bu tahlillerde, direnci ve modellenmiş parametreleri gerçek zamanlı olarak yorumlayarak bu bozulmayı inceledik. ECIS ve cellZscope’un bu tür araştırma sorularının ele alınmasındaki uygulamasıbaşka bir yerde detaylandırılmıştır 39,41,45,46.
İn vitro araştırmalar, hastalığı ilerleten molekülleri ve fonksiyonel yolları ortaya çıkararak önemli hastalık mekanizmalarının keşfedilmesini sağlar. Bununla birlikte, bu, işleyen bir vücuttan önemli ölçüde farklı olan in vitro olarak hastalığın güvenilir bir şekilde tekrarlanmasını gerektirir. İdeal bir senaryoda, in vitro araştırma tekrarlanabilir, non-invaziv, etiketsiz, nicel olmalı ve in vivo bulunan yapısal etkileri taklit etmelidir. Bu makalede, beyin endotel bariyeri bütünlüğünde tedaviye bağlı değişiklikleri ölçmek için bu iki rakip teknolojiyi kullanma metodolojisini detaylandırıyoruz. Engellerin bozulmasının daha kapsamlı bir resmini sağlamak için sonuçlarını birleştirmenin avantajlarını tartışıyor ve hala üstesinden gelinmesi gereken sınırlamaları paylaşıyoruz.
BBB’yi etkileyen hastalıklar üzerine yapılan terapötik çalışmalar, beyin endotel bariyer bütünlüğünün ve regülasyonunun önemini göz önünde bulundurmalıdır. Örneğin, kanserin diğer anatomik bölgelerden beyne metastaz yapmasında beyin endotel bariyerinin bozulması kritik olarak araştırılmaktadır. Bunun nedeni, beyin endotelinin dolaşımdaki tümör hücrelerine karşı ilk bariyeri oluşturmasıdır. Giriş bölümünde daha önce de belirtildiği gibi, endotel bariyer bütünlüğü ile ilgi…
The authors have nothing to disclose.
Akshata Anchan, Yeni Zelanda Nöroloji Vakfı tarafından Gillespie Bursu (hibe referansı: 1628-GS) ve İlk Burs (hibe referansı: 2021 FFE) için finanse edildi. Araştırma maliyeti ayrıca kısmen Nöroloji Vakfı Bursu-2021 FFE ve Auckland Üniversitesi Fakülte Araştırma Geliştirme Fonu tarafından finanse edildi. James Hucklesby, Auckland Tıbbi Araştırma Vakfı’ndan bir bursla finanse edildi. Baguley ekibine ve Auckland Kanser Derneği Araştırma Merkezi’ne hasta kaynaklı Yeni Zelanda Melanom NZM hücre hatları için teşekkürler.
aMEM | Gibco | 12561072 | Melanoma cell base media |
cellZscope array | nanoAnalytics | cellZscope2; software v4.3.1 | TER measuring biosensor array |
Collagen I—rat tail | Gibco | A1048301 | ECM substrate for coating |
dibutyryl-cAMP | Sigma-Aldrich | D0627 | Brain endothelial media supplement |
ECIS array | Applied Biophysics | ECIS ZΘ; software v1.2.163.0 | Rb/Alpha measuring biosensor array |
ECIS plate | Applied Biophysics | 96W20idf | 96-well biosensor plate |
FBS | Sigma-Aldrich | 12203C-500ML | |
GlutaMAX | Gibco | 305050-061 | Brain endothelial media supplement |
hCMVEC | Applied Biological Materials | T0259 | Brain endothelial cell line |
hEGF | PeproTech | PTAF10015100 | Brain endothelial media supplement |
Heparin | Sigma-Aldrich | H-3393 | Brain endothelial media supplement |
hFGF | PeproTech | PTAF10018B50 | Brain endothelial media supplement |
Hydrocortison | Sigma-Aldrich | H0888 | Brain endothelial media supplement |
IL-1β | PeproTech | 200-01B | Cytokine |
Insulin-Transferrin-Sodium Selenite | Sigma-Aldrich | 11074547001 | Melanoma cell media supplement |
M199 | Gibco | 11150-067 | Brain endothelial cell base media |
MilliQ water | Deionized water | ||
PBS 1x | Gibco | 10010-023 | |
TNFα | PeproTech | 300-01A | Cytokine |
Transwell insert | Corning | CLS3464 | Porous membrane insert |
TrypLE Express Enzyme | Gibco | 12604021 | Dissociation reagent |