Realtidsavbildning av akrosomal kalciumdynamik och exocytos i levande musspermier
Summary
Musmodellen AcroSensE och avbildningsmetoderna för levande celler som beskrivs här ger ett nytt tillvägagångssätt för att studera kalciumdynamiken i det subcellulära facket i spermieakrosomen och hur de reglerar mellanliggande steg som leder till membranfusion och akrosomexocytos.
Abstract
Akrosomexocytos (AE), där spermiens enda exocytotiska vesikel smälter samman med plasmamembranet, är en komplex, kalciumberoende process som är nödvändig för befruktning. Vår förståelse av hur kalciumsignalering reglerar AE är dock fortfarande ofullständig. I synnerhet är samspelet mellan intraakrosomal kalciumdynamik och de mellanliggande stegen som leder till biverkning inte väldefinierat. Här beskriver vi en metod som ger rumsliga och tidsmässiga insikter i akrosomal kalciumdynamik och deras relation till membranfusion och efterföljande exocytos av akrosomvesikeln. Metoden använder en ny transgen mus som uttrycker en akrosomriktad sensor för exocytos (AcroSensE). Sensorn kombinerar en genetiskt kodad kalciumindikator (GCaMP) sammansmält med mCherry. Detta fusionsprotein är speciellt utformat för att möjliggöra samtidig observation av akrosomal kalciumdynamik och membranfusionshändelser. Realtidsövervakning av akrosomal kalciumdynamik och AE i levande AcroSensE-spermier uppnås med hjälp av en kombination av avbildning med hög bildfrekvens och ett system för tillförsel av stimulantia som kan rikta in sig på enstaka spermier. Detta protokoll ger också flera exempel på grundläggande metoder för att kvantifiera och analysera rådata. Eftersom AcroSensE-modellen är genetiskt kodad kan dess vetenskapliga betydelse ökas genom att använda lättillgängliga genetiska verktyg, såsom korsning med andra genetiska musmodeller eller genredigeringsbaserade (CRISPR) metoder. Med denna strategi kan rollerna för ytterligare signalvägar i spermiekapacitering och befruktning lösas. Sammanfattningsvis ger metoden som beskrivs här ett bekvämt och effektivt verktyg för att studera kalciumdynamiken i ett specifikt subcellulärt fack – spermieakrosomen – och hur denna dynamik reglerar de mellanliggande stegen som leder till membranfusion och akrosomexocytos.
Introduction
Spermier får förmågan att befrukta under en process som kallas kapacitering1. En slutpunkt för denna process är att spermierna får förmågan att genomgå AE. Över två decennier av data stöder förekomsten av en komplex flerstegsmodell av AE i däggdjursspermier (sammanfattad i 2,3). Att studera biverkning i levande spermier är dock utmanande, och för närvarande tillgängliga metoder för att övervaka denna process med tillräcklig upplösning är besvärliga och kräver flera förberedelsesteg4, är begränsade till detektion av det sista steget av biverkning (t.ex. med hjälp av PNA5), är begränsade till mätningar av förändringar i cytosoliskt kalcium (i motsats till akrosomal kalciumdynamik), eller är begränsade till mätningar av antingen cytosolisk kalciumdynamik eller AE6.
För att övervinna några av de viktigaste begränsningarna med AE-studier i realtid under fysiologiska förhållanden och för att möjliggöra undersökning av samspelet mellan kalciumdynamik och AE, genererades en unik musmodell. I denna musmodell uttrycks och riktas ett fusionsprotein bestående av den genetiskt kodade Ca2+-sensorn (GCaMP3) och mCherry till akrosomen med hjälp av en akrosinpromotor och signalpeptid2. Den riktade dubbla GCaMP3-mCherry-sensorn möjliggör samtidiga realtidsmätningar av kalciumkoncentrationer och status för det akrosomala innehållet i levande spermier under fysiologiska förhållanden med hjälp av mikroskopi och ett encellsstimulerande leveranssystem (figur 1). Som en komponent i den akrosomala matrisen skulle membranfusion och AE resultera i förlust av den fotostabila och pH-okänsliga mCherry-fluorescensen från spermierna, eftersom detta protein diffunderar ut ur akrosomvesikeln. I detta avseende är modellens förmåga att återspegla tidpunkten och förekomsten av AE besläktad med fördelarna med den akrosomriktade GFP-muslinjen 7,8,9.
GCaMP3-varianten som används i denna transgena muslinje har en ungefärlig KD på 400 μM och ett dynamiskt omfång för Ca2+ på 10-4-10-3 M10, vilket är lämpligt för denna vesikel. Vi visade att denna kombination av egenskaper hos GCaMP3 kunde avslöja fusionsporbildning mellan plasmamembranet och det yttre akrosomala membranet (OAM)2. Fusionspordetektionen är ett resultat av att porstorleken är för liten för att AcroSensE-proteinet ska kunna spridas ut ur akrosomen (via förlust av akrosominnehåll) samtidigt som det ger en membrankanal som möjliggör inflödet av Ca2+-joner in i akrosomlumen, vilket leder till en ökning av fluorescensintensiteten hos GCaMP3.
Det ljusa, monomera, icke-kalciumkänsliga fluorescerande proteinet mCherry stöder visualisering av akrosomen medan GCaMP3-signalen är svag (t.ex. före Ca2+ -bindning, figur 2), och det möjliggör också identifiering av akrosomintakta spermier som är lämpliga för avbildning.
Följande protokoll beskriver användningen av den unika musmodellen AcroSensE och de metoder för mikroskopi som används experimentellt för att studera AE och spermiekalciumdynamik med hög rumslig och tidsmässig upplösning.
Protocol
Representative Results
Discussion
Här beskrivs en mikroskopibaserad metod för att använda den nygenererade AcroSensE-musmodellen för realtidsövervakning och analys av samspelet mellan akrosomal kalciumdynamik och mellansteg som leder till AE. Tillsammans med lättillgängliga genetiska metoder, såsom korsning med andra musgenetiska modeller eller genredigering, ger denna modell och metod ett kraftfullt system för att studera rollen för olika komponenter och vägar som deltar i spermiesignalvägar relaterade till kapacitering, AE och befruktning.<…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av National Institutes of Health-anslagen R01-HD093827 och R03-HD090304 (A.J.T).
Materials
| 100x oil objective | Olympus Japan | UPlanApo, | |
| 2-hydroxypropyl-b-cyclodextrin | Sigma | C0926 | |
| 35 mm coverslip dish, 1.5 thickness | MatTek Corp. | P35G-1.5-20-C | |
| 5 mL round-bottomed tube | Falcon | 352054 | |
| Borosilicate glass capilarries | Sutter Instrument Co. CA USA | B200-156-10 | |
| CaCl2 | Sigma | C4901 | |
| Confocal microscope | Olympus Japan | Olympus FluoView | |
| Glucose | Sigma | G7528 | |
| Graduated tip | TipOne, USA Scientific | ||
| HEPES | Sigma | H7006 | |
| ImageJ | National Institutes of Health | https://imagej.nih.gov/ij/plugins/index.html | |
| KCl | Sigma | P9541 | |
| Lactic acid | Sigma | G5889 | |
| Live-Cell Microscope Incubation Systems | TOKAI HIT Shizuoka, Japan | Model STX | |
| MgCl2 | Sigma | M8266 | |
| Micropipette Puller | Sutter Instrument Co. CA USA | Model P-97 | |
| NaCl | Sigma | S3014 | |
| NaHCO3 | Sigma | S6297 | |
| Plastic transfer pipette | FisherBrand | 13-711-6M | |
| Poly-D-lysine | Sigma | P7280 | |
| Pyruvic acid | Sigma | 107360 | |
| Single cell delivery system | Parker, Hauppauge, NY | Picospritzer III |
References
- Austin, C. R. Observations on the penetration of the sperm in the mammalian egg. Aust J Sci Res B. 4 (4), 581-596 (1951).
- Cohen, R., et al. A genetically targeted sensor reveals spatial and temporal dynamics of acrosomal calcium and sperm acrosome exocytosis. J Biol Chem. 298 (5), 101868 (2022).
- Cohen, R., Mukai, C., Travis, A. J. Lipid regulation of acrosome exocytosis. Adv Anat Embryol Cell Biol. 220, 107-127 (2016).
- Harper, C. V., Cummerson, J. A., White, M. R., Publicover, S. J., Johnson, P. M. Dynamic resolution of acrosomal exocytosis in human sperm. J Cell Sci. 121, 2130-2135 (2008).
- Sosa, C. M., et al. Kinetics of human sperm acrosomal exocytosis). Mol Hum Reprod. 21 (3), 244-254 (2015).
- Balestrini, P. A., et al. Seeing is believing: Current methods to observe sperm acrosomal exocytosis in real time. Mol Reprod Dev. 87 (12), 1188-1198 (2020).
- Nakanishi, T., et al. Real-time observation of acrosomal dispersal from mouse sperm using GFP as a marker protein. FEBS Lett. 449 (2-3), 277-283 (1999).
- Kim, K. S., Gerton, G. L. Differential release of soluble and matrix components: evidence for intermediate states of secretion during spontaneous acrosomal exocytosis in mouse sperm. Dev Biol. 264 (1), 141-152 (2003).
- Hasuwa, H., et al. Transgenic mouse sperm that have green acrosome and red mitochondria allow visualization of sperm and their acrosome reaction in vivo. Experimental animals / Japanese Association for Laboratory Animal Science. 59 (1), 105-107 (2010).
- Henderson, M. J., et al. A Low-Affinity GCaMP3 Variant (GCaMPer) for imaging the endoplasmic reticulum calcium store. PloS one. 10 (10), 0139273 (2015).
- Travis, A. J., et al. Functional relationships between capacitation-dependent cell signaling and compartmentalized metabolic pathways in murine spermatozoa. J Biol Chem. 276 (10), 7630-7636 (2001).
- Cohen, R., et al. Lipid modulation of calcium flux through CaV2.3 regulates acrosome exocytosis and fertilization. Dev Cell. 28 (3), 310-321 (2014).
- Sanchez-Cardenas, C., et al. Acrosome reaction and Ca(2)(+) imaging in single human spermatozoa: new regulatory roles of [Ca(2)(+)]i. Biol Reprod. 91 (2), 67 (2014).
