Summary

Demonstration af selvsamlet cellearkkultur og manuel generering af en 3D-sene-/ledbåndslignende organoid ved hjælp af humane dermale fibroblaster

Published: June 21, 2024
doi:

Summary

Heri demonstrerer vi en tre-trins organoidmodel (todimensionel [2D] ekspansion, 2D-stimulering, tredimensionel [3D] modning), der tilbyder et lovende værktøj til senegrundforskning og en potentiel stilladsfri metode til senevævsteknik.

Abstract

Sener og ledbånd (T / L) er stærke hierarkisk organiserede strukturer, der forener muskuloskeletalsystemet. Disse væv har en strengt arrangeret kollagen type I-rig ekstracellulær matrix (ECM) og T / L-afstamningsceller hovedsageligt placeret i parallelle rækker. Efter skade kræver T / L lang tid til rehabilitering med høj fejlrisiko og ofte utilfredsstillende reparationsresultater. På trods af de seneste fremskridt inden for T / L biologiforskning er en af de resterende udfordringer, at T / L-feltet stadig mangler en standardiseret differentieringsprotokol, der er i stand til at rekapitulere T / L-dannelsesprocessen in vitro. For eksempel kræver knogle- og fedtdifferentiering af mesenkymale forløberceller kun standard todimensionel (2D) cellekultur og tilsætning af specifikke stimuleringsmedier. For differentiering til brusk er tredimensionel (3D) pelletkultur og tilskud af TGFß nødvendig. Imidlertid kræver celledifferentiering til sener en meget ordnet 3D-kulturmodel, som ideelt set også bør kunne udsættes for dynamisk mekanisk stimulering. Vi har etableret en 3-trins (ekspansion, stimulering og modning) organoidmodel til dannelse af en 3D-stanglignende struktur ud af et selvmonteret celleark, som leverer et naturligt mikromiljø med sine egne ECM-, autokrine- og parakrinefaktorer. Disse stanglignende organoider har en flerlags cellulær arkitektur inden for rig ECM og kan håndteres ganske let til eksponering for statisk mekanisk belastning. Her demonstrerede vi 3-trinsprotokollen ved hjælp af kommercielt tilgængelige dermale fibroblaster. Vi kunne vise, at denne celletype danner robuste og ECM-rigelige organoider. Den beskrevne procedure kan optimeres yderligere med hensyn til kulturmedier og optimeres mod dynamisk aksial mekanisk stimulering. På samme måde kan alternative cellekilder testes for deres potentiale til at danne T / L-organoider og dermed gennemgå T / L-differentiering. Alt i alt kan den etablerede 3D T / L organoid tilgang bruges som en model for senegrundforskning og endda til stilladsfri T / L-teknik.

Introduction

Sener og ledbånd (T / L) er vitale komponenter i muskuloskeletalsystemet, der giver væsentlig støtte og stabilitet til kroppen. På trods af deres kritiske rolle er disse bindevæv tilbøjelige til degeneration og skade, hvilket forårsager smerte og svækkelse af mobilitet1. Desuden kan deres begrænsede blodforsyning og langsomme helingskapacitet føre til kroniske skader, mens faktorer som aldring, gentagne bevægelser og forkert rehabilitering yderligere øger risikoen for degeneration og skade2. Konventionelle behandlinger, såsom hvile, fysioterapi og kirurgiske indgreb, er ikke i stand til fuldt ud at genoprette T / L-strukturen og funktionen. I løbet af de sidste par år har forskere stræbt efter bedre at forstå den indviklede karakter af T / L for at søge effektive behandlinger for T / L lidelser 3,4,5. T / L er kendetegnet ved en hierarkisk organiseret, ekstracellulær matrix (ECM) -domineret struktur, der primært består af type I kollagenfibre og proteoglycaner, en funktion, der er vanskelig at replikere in vitro6. Traditionelle todimensionelle (2D) cellekulturmodeller fanger ikke den karakteristiske tredimensionelle (3D) organisering af T / L-væv, hvilket begrænser deres translationelle potentiale samt hindrer de innovative fremskridt inden for T / L-regenerering.

For nylig har udviklingen af 3D-organoidmodeller givet nye muligheder for at fremme grundforskning og stilladsfri vævsteknik af forskellige vævstyper 7,8,9,10,11,12,13. For eksempel for at undersøge myotendinøs krydsning udviklede Larkin et al. 2006 3D-skeletmuskelkonstruktioner sammen med selvorganiserede senesegmenter afledt af rottehalesenen10. Desuden dirigerede Schiele et al. 2013 ved hjælp af mikrobearbejdede fibronectinbelagte vækstkanaler selvmontering af humane dermale fibroblaster til dannelse af cellulære fibre uden hjælp fra 3D-stillads, en tilgang, der kan fange nøgletræk ved embryonal seneudvikling11. I undersøgelsen af Florida et al. 2016 blev knoglemarvstromale celler først udvidet til knogle- og ligamentlinjer, der derefter blev brugt til at generere selvmonterede enkeltlagscelleark, som derefter blev implementeret for at skabe en multifasisk knogle-ligament-knoglekonstruktion, der efterligner det indfødte forreste korsbånd, en model, der sigter mod forbedret forståelse af ligamentregenerering12. For at belyse senemekanotransduktionsprocesser anvendte Mubyana et al. 2018 en stilladsfri metode, hvormed enkelte senefibre blev skabt og udsat for mekanisk belastningsprotokol13. Organoider er selvorganiserede 3D-strukturer, der efterligner vævets oprindelige arkitektur, mikromiljø og funktionalitet. 3D organoidkulturer giver en mere fysiologisk relevant model til at studere vævs- og organbiologi samt patofysiologi. Sådanne modeller kan også anvendes til at inducere vævsspecifik differentiering af forskellige stam-/stamcelletyper14,15. Derfor bliver implementering af 3D-organoidmodeller inden for T / L-biologi og vævsteknik en meget attraktiv tilgang 9,16. Alternative cellekilder kan implementeres til organoidsamlingen og stimuleres mod tenogen differentiering. En relevant celletype, der anvendes til demonstration i denne undersøgelse, er dermale fibroblaster 7,17,18. Disse celler er let tilgængelige gennem en hudbiopsiprocedure, som er mindre invasiv sammenlignet med knoglemarvspunktur eller fedtsugning og kan multipliceres ret hurtigt til store tal på grund af deres gode proliferative kapacitet. I modsætning hertil er mere specialiserede celletyper, såsom T / L-residente fibroblaster, mere udfordrende at isolere og udvide. Derfor blev dermale fibroblaster også anvendt som udgangspunkt for celleprogrammeringsteknologier til inducerede pluripotente embryonale stamceller19. At udsætte dermale fibroblaster for specifikke 3D-kulturbetingelser og signalsignaler, såsom transformering af vækstfaktor-beta 3 (TGFß3), som er rapporteret at fungere som en nøgleregulator for forskellige cellulære processer, herunder dannelse og vedligeholdelse af T/L, kan forstærke deres in vitro tenogene differentiering, hvilket fører til ekspression af senespecifikke gener og deponering af T/L-typisk ECM20, 21.

Her beskriver og demonstrerer vi en tidligere etableret og implementeret 3-trins (2D-ekspansion, 2D-stimulering og 3D-modning) organoidprotokol ved hjælp af kommercielt tilgængelige normale voksne humane dermale fibroblaster (NHDF’er) som cellekilde, der tilbyder en værdifuld model til undersøgelse af in vitro tenogenese7. På trods af at denne model ikke svarer til in vivo T / L-væv, giver den stadig et mere fysiologisk relevant system, der kan bruges til at undersøge cellulære differentieringsmekanismer, efterligne T / L patofysiologi in vitro og etablere T / L personlig medicin og lægemiddelscreeningsplatforme. Desuden kan undersøgelser i fremtiden evaluere, om 3D-organoiderne er egnede til stilladsfri T/L-konstruktion ved yderligere optimering samt anvendelige til udvikling af opskalerede mekanisk robuste konstruktioner, der ligner dimensionerne og strukturelle og biofysiske egenskaber af naturligt T/L-væv.

Protocol

BEMÆRK: Alle trin skal udføres ved hjælp af aseptiske teknikker. 1. Kultur og præ-udvidelse af NHDF’er Kryohætteglasset, der indeholder voksne kryopræserverede normale humane dermale fibroblaster (NHDF’er, 1 x 106 celler) ved 37 °C, tøs hurtigt op, indtil de næsten optøes. Tilsæt langsomt 1 ml forvarmet fibroblastvækstmedium 2 (brugsklart sæt inklusive basalmedium, 2% føtalt kalveserum (FCS), basisk fibroblastvækstfaktor (bFGF) og …

Representative Results

3D T/L organoidmodellen blev tidligere etableret og demonstreret her ved implementering af kommercielt indkøbt NHDF (n=3, 3 organoider pr. donor, NHDF blev brugt ved passager 5-8). Modelarbejdsgangen er opsummeret i figur 1. Figur 2 viser repræsentative fasekontrastbilleder af NHDF-kultur under præekspansion i T-75-kolber (figur 2A) samt i begyndelsen og efter 5 dages dyrkning i 2D-ekspansionstrinnet i 10 cm cellekulturskåle (<s…

Discussion

Resultaterne demonstreret i denne undersøgelse giver værdifuld indsigt i etablering og karakterisering af NHDF 3D organoid model til undersøgelse af T / L væv. 3-trinsprotokollen førte til dannelsen af 3D-stanglignende organoider, der udviser typiske træk ved T / L-niche. Denne model er tidligere omtalt i Kroner-Weigl et al. 20237 og demonstreret meget detaljeret her.

Fasekontrastbillederne vist i figur 2 viste progressionen …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

D.D. og S.M.-D. anerkende BMBF-bevillingen “CellWiTaL: Reproducerbare cellesystemer til lægemiddelforskning – overførselslagfri laserudskrivning af meget specifikke enkeltceller i tredimensionelle cellulære strukturer” Forslag nr. 13N15874. D.D. og V.R.A. anerkender EU MSCA-COFUND Grant OSTASKILLS “Holistisk træning af næste generations slidgigtforskning” GA Nr. 101034412. Alle forfattere anerkender fru Beate Geyer for teknisk assistance.

Materials

Ascorbic acid   Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany   A8960
10 cm adherent cell culture dish Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  CLS430167
10 cm non-adherent petri dish  Sigma-Aldrich, Taufkirchen,Germany  CLS430591
Cryo-medium Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands   4583
Cryomold standard  Tissue-Tek, Sakura Finetek, Alphen aan den Rijn, Netherlands 4557
D(+)-Sucrose  AppliChem Avantor VWR International GmbH, Darmstadt, Germany A2211
DMEM high glucose medium  Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany  DMEM-HA
DMEM low glucose Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany   DMEM-LPXA
Fetal bovine serum  Anprotec, Bruckberg, Germany  AC-SM-0027
Fibroblast growth medium 2  PromoCell, Heidelberg, Germany   C-23020
Inverted microscope with high resolution camera Zeiss NA Zeiss Axio Observer with  Axiocam 506
MEM amino acids  Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany   NEAA-B
Metal pins  EntoSphinx, Pardubice, Czech Republic  04.31
Normal human dermal fibroblasts   PromoCell, Heidelberg, Germany  C-12302
Paraformaldehyde  AppliChem, Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany  A3813
Penicillin/streptomycin  Gibco, Thermo Fisher Scientific, Darmstadt, Germany 15140122
Phosphate buffer saline  Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Germany  P4417
TGFß3  R&D Systems, Wiesbaden, Germany   8420-B3
Trypsin-EDTA 0,05% DPBS  Capricorn Scientific, Ebsdorfergrund, Germany   TRY-1B

References

  1. Schneider, M., Angele, P., Järvinen, T. A. H., Docheva, D. Rescue plan for Achilles: Therapeutics steering the fate and functions of stem cells in tendon wound healing. Adv Drug Deliv Rev. 129, 352-375 (2018).
  2. Steinmann, S., Pfeifer, C. G., Brochhausen, C., Docheva, D. Spectrum of tendon pathologies: Triggers, trails and end-state. Int J Mol Sci. 21 (3), 844 (2020).
  3. Snedeker, J. G., Foolen, J. Tendon injury and repair – A perspective on the basic mechanisms of tendon disease and future clinical therapy. Acta Biomater. 63, 18-36 (2017).
  4. Lomas, A. J., et al. The past, present and future in scaffold-based tendon treatments. Adv Drug Deliv Rev. 84, 257-277 (2015).
  5. Gomez-Florit, M., Labrador-Rached, C. J., Domingues, R. M. A., Gomes, M. E. The tendon microenvironment: Engineered in vitro models to study cellular crosstalk. Adv Drug Deliv Rev. 185, 114299 (2022).
  6. Docheva, D., Müller, S. A., Majewski, M., Evans, C. H. Biologics for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 222-239 (2015).
  7. Kroner-Weigl, N., Chu, J., Rudert, M., Alt, V., Shukunami, C., Docheva, D. Dexamethasone Is not sufficient to facilitate tenogenic differentiation of dermal fibroblasts in a 3D organoid model. Biomedicines. 11 (3), 772 (2023).
  8. Chu, J., Pieles, O., Pfeifer, C. G., Alt, V., Morsczeck, C., Docheva, D. Dental follicle cell differentiation towards periodontal ligament-like tissue in a self-assembly three-dimensional organoid model. Eur Cell Mater. 42, 20-33 (2021).
  9. Yan, Z., Yin, H., Brochhausen, C., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Aged tendon stem/progenitor cells are less competent to form 3D tendon organoids due to cell autonomous and matrix production deficits. Front Bioeng Biotechnol. 8, 406 (2020).
  10. Larkin, L. M., Calve, S., Kostrominova, T. Y., Arruda, E. M. Structure and functional evaluation of tendon-skeletal muscle constructs engineered in vitro. Tissue Eng. 12 (11), 3149-3158 (2006).
  11. Schiele, N. R., Koppes, R. A., Chrisey, D. B., Corr, D. T. Engineering cellular fibers for musculoskeletal soft tissues using directed self-assembly. Tissue Eng Part A. 19 (9-10), 1223-1232 (2013).
  12. Florida, S. E., et al. In vivo structural and cellular remodeling of engineered bone-ligament-bone constructs used for anterior cruciate ligament reconstruction in sheep. Connect Tissue Res. 57 (6), 526-538 (2016).
  13. Mubyana, K., Corr, D. T. Cyclic uniaxial tensile strain enhances the mechanical properties of engineered, scaffold-free tendon fibers. Tissue Eng Part A. 24 (23-24), 1808-1817 (2018).
  14. Brassard, J. A., Lutolf, M. P. Engineering stem cell self-organization to build better organoids. Cell Stem Cell. 24 (6), 860-876 (2019).
  15. Kim, J., Koo, B. K., Knoblich, J. A. Human organoids: model systems for human biology and medicine. Nat Rev Mol Cell Biol. 21 (10), 571-584 (2020).
  16. Hsieh, C. F., et al. In vitro comparison of 2D-cell culture and 3D-cell sheets of scleraxis-programmed bone marrow derived mesenchymal stem cells to primary tendon stem/progenitor cells for tendon repair. Int J Mol Sci. 19 (8), 2272 (2018).
  17. Chu, J., Lu, M., Pfeifer, C. G., Alt, V., Docheva, D. Rebuilding tendons: A concise review on the potential of dermal fibroblasts. Cells. 9 (9), 2047 (2020).
  18. Gaspar, D., Spanoudes, K., Holladay, C., Pandit, A., Zeugolis, D. Progress in cell-based therapies for tendon repair. Adv Drug Deliv Rev. 84, 240-256 (2015).
  19. Sacco, A. M., et al. Diversity of dermal fibroblasts as major determinant of variability in cell reprogramming. J Cell Mol Med. 23 (6), 4256-4268 (2019).
  20. Wang, W., et al. Induction of predominant tenogenic phenotype in human dermal fibroblasts via synergistic effect of TGF-β and elongated cell shape. Am J Physiol Cell Physiol. 310 (5), C357-C372 (2016).
  21. Pryce, B. A., Watson, S. S., Murchison, N. D., Staverosky, J. A., Dünker, N., Schweitzer, R. Recruitment and maintenance of tendon progenitors by TGFbeta signaling are essential for tendon formation. Development. 136 (8), 1351-1361 (2009).
  22. Pattappa, G., et al. Physioxia has a beneficial effect on cartilage matrix production in interleukin-1 beta-inhibited mesenchymal stem cell chondrogenesis. Cells. 8 (8), 936 (2019).
  23. Shafiee, A., et al. Development of physiologically relevant skin organoids from human induced pluripotent stem cells. Small. 2304879, (2023).
  24. Zeiger, A. S., Hinton, B., Van Vliet, K. J. Why the dish makes a difference: quantitative comparison of polystyrene culture surfaces. Acta Biomater. 9 (7), 7354-7361 (2013).
  25. Koh, T. M., Feih, S., Mouritz, A. P. Strengthening mechanics of thin and thick composite T-joints reinforced with z-pins. Compos Part A Appl Sci. 43 (8), 1308-1317 (2012).
  26. Gelberman, R. H., et al. Combined administration of ASCs and BMP-12 promotes an M2 macrophage phenotype and enhances tendon healing. Clin Orthop Relat Res. 475 (9), 2318-2331 (2017).
  27. Hofer, M., Lutolf, M. P. Engineering organoids. Nat Rev Mater. 6 (5), 402-420 (2021).
  28. Driehuis, E., et al. Pancreatic cancer organoids recapitulate disease and allow personalized drug screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (52), 26580-26590 (2019).
  29. Yan, H. H. N., et al. A comprehensive human gastric cancer organoid biobank captures tumor subtype heterogeneity and enables therapeutic screening. Cell Stem Cell. 23 (6), 882-897 (2018).

Play Video

Cite This Article
Graça, A. L., Kroner-Weigl, N., Reyes Alcaraz, V., Müller-Deubert, S., Rudert, M., Docheva, D. Demonstration of Self-Assembled Cell Sheet Culture and Manual Generation of a 3D Tendon/Ligament-Like Organoid by using Human Dermal Fibroblasts. J. Vis. Exp. (208), e66047, doi:10.3791/66047 (2024).

View Video