Hurtige og præcise kemiske assays til screening for specifikke hæmmere er et vigtigt værktøj i arsenalet af lægemiddeludvikling. Her præsenterer vi et skalerbart acetyl-klik-kemiassay til måling af hæmningen af HAT1-acetyleringsaktivitet.
HAT1, også kendt som histonacetyltransferase 1, spiller en afgørende rolle i kromatinsyntese ved at stabilisere og acetylere spirende H4 før nukleosomsamling. Det er nødvendigt for tumorvækst i forskellige systemer, hvilket gør det til et potentielt mål for kræftbehandling. For at lette identifikationen af forbindelser, der kan hæmme HAT1 enzymatisk aktivitet, har vi udtænkt et acetyl-klik-assay til hurtig screening. I denne enkle analyse anvender vi rekombinant HAT1 / Rbap46, som renses fra aktiverede humane celler. Metoden anvender acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klik-kemi tilgang. Dette involverer enzymatisk overførsel af et alkynhåndtag gennem en HAT1-afhængig acyleringsreaktion til et biotinyleret H4 N-terminalt peptid. Det fangede peptid immobiliseres derefter på neutravidinplader efterfulgt af klikkemifunktionalisering med biotinazid. Derefter anvendes streptavidin-peroxidaserekruttering til at oxidere amplex rød, hvilket resulterer i en kvantitativ fluorescerende udgang. Ved at indføre kemiske hæmmere under acyleringsreaktionen kan vi kvantificere enzymatisk hæmning baseret på en reduktion af fluorescenssignalet. Det er vigtigt, at denne reaktion er skalerbar, hvilket muliggør screening med høj gennemstrømning af potentielle hæmmere for HAT1 enzymatisk aktivitet.
Blandt de mange eukaryote acetyltransferaser var HAT1 den oprindelige histonacetyltransferase, der skulle isoleres 1,2,3. Efterfølgende undersøgelser har fast etableret sin centrale rolle i kromatinreplikation, især i syntesen af nye nukleosomer under S-fase4. Vores forskningsbestræbelser førte til erkendelsen af, at HAT1 i høj grad stimuleres af epidermal vækstfaktor (EGF) behandling i brystceller5. Desuden er det kommet frem, at HAT1 er nødvendig for hurtig celleproliferation og tumordannelse in vivo 6,7,8,9. Data indikerer, at HAT1 er afgørende for at koordinere anabolske og epigenetiske processer til celledeling, hvilket driver tumorvækst.
HAT1 di-acetylerer den aminoterminale hale af histon H4 på lysiner 5 og 12 i kompleks med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen og præsenterer aminoterminalen til HAT1. Histontetramerer eller disomer10 sammen med HAT1/Rbap46 og andre histonchaperoner11 importeres derefter til kernen. Histoner frigives derefter for at blive deponeret ved replikationsgaflen eller andre steder for at understøtte genaktivering eller undertrykkelse. Funktionen af HAT1-di-acetyleringsmærket på histon H4 forstås ikke fuldt ud. Det fjernes sandsynligvis hurtigt inden for et tidsrum på 15-30 minutter ved virkningen af histondeacetylaser 12,13,14,15 efter H4 er indsat i kromatin. Således formeres HAT1-di-acetyleringsmærket ikke i kromatin og tjener muligvis ikke en ægte epigenetisk rolle, selvom en rolle i rekrutteringen af kromatinmodificerende enzymer til spirende kromatin er blevet postuleret12. HAT1 acetylerer heller ikke direkte kromatin; Dens aktivitet er begrænset til opløselige histoner.
Udviklingen af småmolekylære histonacetyltransferasehæmmere er blevet hæmmet af uspecifikke analyser med lav kapacitet, hvilket ofte resulterer i dannelsen af biologisk reaktive forbindelser16,17. Guldstandardanalysen til måling af acetyltransferaseaktiviteter kræver anvendelse af 3H-acetyl-coA, hvilket begrænser gennemstrømningen og kræver stråling. Ikke desto mindre er specifikke og højpotente acetyltransferasehæmmere med små molekyler rettet mod CBP/p30018 og KAT6A/B19,20 for nylig blevet beskrevet og bekræftet ved anvendelse af 3H-acetyl-CoA. Fremadrettet udtænkes forbedrede analyser for at opnå bedre gennemstrømning og undgå laboratoriefarer.
Nylige fremskridt inden for acetyleringsovervågning21 har brugt klikkemi til at muliggøre enzymatisk reaktionsovervågning. Der er en række klikaktiverede forløbere, der er tilgængelige via enkle syntetiske ruter eller kan købes, der kan inkorporeres i enzymreaktioner. Disse reaktioner udføres typisk i rekombinante systemer, selvom cellebaserede assays også er mulige22. Fordelen ved klikaktiverede co-faktorer og substrater er, at screening direkte kan måle enzymaktivitet uden behov for koblede udlæsningssystemer, der ofte forstyrres af screeningsforbindelser og kræver yderligere håndteringstrin. Dette tillader kun inhibitorbehandlinger under det enzymatiske trin, mens alle nedstrøms funktionaliserings- og detektionstrin udføres efter omfattende vask for at fjerne forbindelser, hvilket begrænser potentialet for assayinterferens. Disse fordele gør designet af klikaktiverede assays at foretrække frem for koblede assays, der almindeligvis er afhængige af påvisning af frit coenzym A.
En vigtig overvejelse er accepten af klikaktiverede co-faktorer i enzymets aktive site. Eksisterende klikaktiverede cofaktorer er muligvis ikke fuldt kompatible med det aktive website, der er optimeret til den oprindelige cofaktor. Strukturel information og modellering kan bruges til at designe aminosyresubstitutioner for at forstørre det aktive sted for at inkorporere ændrede substrater23. Dette kan muliggøre screening med forbedret enzymkinetik og lavere substrat- og enzymniveauer. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at ændrede katalytiske lommer muligvis ikke identificerer hæmmere, der interagerer stærkt med det oprindelige enzym. I sidste ende kræves en kombination af tilgange for at identificere og validere potentielle enzymhæmmere.
Her beskriver vi en metode udviklet til at oprense og assay HAT1-enzymaktivitet ved hjælp af klik-co-faktor 4-pentynoyl-CoA24. Dette assay (figur 1) bruger den oprindelige enzymsekvens i kompleks med dets krævede partnerprotein Rbap46, som har vist sig at øge enzymaktiviteten. Oprensning af enzymet fra humane celler muliggør enzymaktivering i cellulo, hvilket kan bevare stimulerende posttranslationelle modifikationer, der er vigtige for fuld enzymaktivitet. Design og optimering af rekombinante enzymassays til kemiske skærme med høj kapacitet er med succes blevet brugt til at identificere og karakterisere HAT1 små molekylehæmmere.
I det sidste årti blev klikkemi fremtrædende20, hvilket muliggør præcis design af interagerende kemiske strukturer. Inden for denne sammenhæng har forskellige bioortogonale kovalente forbindelser21 vist sig som lovende muligheder for dannelse af komplekser i deres naturlige miljø. Klikkemi anvender par af funktionelle grupper, der udviser hurtige og selektive reaktioner, almindeligvis kendt som “klikreaktioner”. Disse reaktioner forekommer effektivt under miljøvenlig…
The authors have nothing to disclose.
Vi takker George Zheng for at levere H4K12CoA. Vi takker medlemmer af Gruber Lab for nyttige diskussioner og feedback. Vi takker støtten fra NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) og V Foundation (V2022-022).
4P CoA | Cayman Chemical | 10547 | Click chemistry co-factor |
Amplex Red | Fisher Sci | A12222 | Fluorescence substrate |
Biotin-PEG-Azide | Alfa Aesar | J64996MC | Click chemistry |
Copper Sulfate | Sigma-aldrich | 7758-98-7 | Click chemistry |
DMSO | Fisher Scientific | 67-68-5 | diluent |
DTT | Acros Organics | 03-12-3483 | reducting agent |
Forskolin | VWR | 102987-310 | Protein expression |
Freestyle 293 Expression Medium | Thermo Fisher | 12338018 | Media |
Freestyle 293-F cells | Thermo Fisher | R790-07 | Protein expression |
H4-peptide/1-23-GGK-biotin | Anaspec | AS65097 | peptide substrate |
HEPES | Sigma-aldrich | 7365-45-9 | EB buffer |
Hydrogen peroxide 30% solution | Sigma-aldrich | Z00183-99-0 | initiator |
M2 FLAG antibody slurry | Millipore-Sigma | A2220 | Protein purification |
Macrosep 10K Filter (Pall Lab) | VWR | 89131-980 | Protein purification |
Neutravidin Plate | Thermo Sci | 15127 | BSA-pre-blocked |
NP40 (IGEPAL) | MP Biomedical | 198596 | 20x buffer |
pHEK-293 plasmid | Takara Bio | 3390 | Protein expression |
Phosphate Buffered Saline 10x | Alfa Aesar | Z00082-33-6 | wash buffer |
Pra peptide | Genscript | Custom synthesis | biotinylated |
Sodium Ascorbate | Sigma-aldrich | 134-03-2 | Click chemistry |
Sodium chloride | Sigma-aldrich | 7647-14-5 | EB buffer |
Sodium phosphate | VWR International | 7558-80-7 | buffer |
Streptavidin | EMD Millipore | 189730 | competitor |
Streptavidin-HRP | Cell Signaling | 3999S | enzyme |
THPTA ligand | Fisher Sci | 1010-500 | Click chemistry |
Tris base | Sigma-aldrich | 77-86-1 | 20x buffer |
Triton-X 100 | VWR International | 9002-93-1 | EB buffer |
Tween-20 | Sigma-aldrich | 9005-64-5 | Wash buffer |
Urea | Sigma-Aldrich | 57-13-6 | quencher |