Summary

En acetyl-klik kemi assay til måling af histon acetyltransferase 1 acetylering

Published: January 26, 2024
doi:

Summary

Hurtige og præcise kemiske assays til screening for specifikke hæmmere er et vigtigt værktøj i arsenalet af lægemiddeludvikling. Her præsenterer vi et skalerbart acetyl-klik-kemiassay til måling af hæmningen af HAT1-acetyleringsaktivitet.

Abstract

HAT1, også kendt som histonacetyltransferase 1, spiller en afgørende rolle i kromatinsyntese ved at stabilisere og acetylere spirende H4 før nukleosomsamling. Det er nødvendigt for tumorvækst i forskellige systemer, hvilket gør det til et potentielt mål for kræftbehandling. For at lette identifikationen af forbindelser, der kan hæmme HAT1 enzymatisk aktivitet, har vi udtænkt et acetyl-klik-assay til hurtig screening. I denne enkle analyse anvender vi rekombinant HAT1 / Rbap46, som renses fra aktiverede humane celler. Metoden anvender acetyl-CoA analog 4-pentynoyl-CoA (4P) i en klik-kemi tilgang. Dette involverer enzymatisk overførsel af et alkynhåndtag gennem en HAT1-afhængig acyleringsreaktion til et biotinyleret H4 N-terminalt peptid. Det fangede peptid immobiliseres derefter på neutravidinplader efterfulgt af klikkemifunktionalisering med biotinazid. Derefter anvendes streptavidin-peroxidaserekruttering til at oxidere amplex rød, hvilket resulterer i en kvantitativ fluorescerende udgang. Ved at indføre kemiske hæmmere under acyleringsreaktionen kan vi kvantificere enzymatisk hæmning baseret på en reduktion af fluorescenssignalet. Det er vigtigt, at denne reaktion er skalerbar, hvilket muliggør screening med høj gennemstrømning af potentielle hæmmere for HAT1 enzymatisk aktivitet.

Introduction

Blandt de mange eukaryote acetyltransferaser var HAT1 den oprindelige histonacetyltransferase, der skulle isoleres 1,2,3. Efterfølgende undersøgelser har fast etableret sin centrale rolle i kromatinreplikation, især i syntesen af nye nukleosomer under S-fase4. Vores forskningsbestræbelser førte til erkendelsen af, at HAT1 i høj grad stimuleres af epidermal vækstfaktor (EGF) behandling i brystceller5. Desuden er det kommet frem, at HAT1 er nødvendig for hurtig celleproliferation og tumordannelse in vivo 6,7,8,9. Data indikerer, at HAT1 er afgørende for at koordinere anabolske og epigenetiske processer til celledeling, hvilket driver tumorvækst.

HAT1 di-acetylerer den aminoterminale hale af histon H4 på lysiner 5 og 12 i kompleks med chaperonproteinet Rbap46, som binder histonen og præsenterer aminoterminalen til HAT1. Histontetramerer eller disomer10 sammen med HAT1/Rbap46 og andre histonchaperoner11 importeres derefter til kernen. Histoner frigives derefter for at blive deponeret ved replikationsgaflen eller andre steder for at understøtte genaktivering eller undertrykkelse. Funktionen af HAT1-di-acetyleringsmærket på histon H4 forstås ikke fuldt ud. Det fjernes sandsynligvis hurtigt inden for et tidsrum på 15-30 minutter ved virkningen af histondeacetylaser 12,13,14,15 efter H4 er indsat i kromatin. Således formeres HAT1-di-acetyleringsmærket ikke i kromatin og tjener muligvis ikke en ægte epigenetisk rolle, selvom en rolle i rekrutteringen af kromatinmodificerende enzymer til spirende kromatin er blevet postuleret12. HAT1 acetylerer heller ikke direkte kromatin; Dens aktivitet er begrænset til opløselige histoner.

Udviklingen af småmolekylære histonacetyltransferasehæmmere er blevet hæmmet af uspecifikke analyser med lav kapacitet, hvilket ofte resulterer i dannelsen af biologisk reaktive forbindelser16,17. Guldstandardanalysen til måling af acetyltransferaseaktiviteter kræver anvendelse af 3H-acetyl-coA, hvilket begrænser gennemstrømningen og kræver stråling. Ikke desto mindre er specifikke og højpotente acetyltransferasehæmmere med små molekyler rettet mod CBP/p30018 og KAT6A/B19,20 for nylig blevet beskrevet og bekræftet ved anvendelse af 3H-acetyl-CoA. Fremadrettet udtænkes forbedrede analyser for at opnå bedre gennemstrømning og undgå laboratoriefarer.

Nylige fremskridt inden for acetyleringsovervågning21 har brugt klikkemi til at muliggøre enzymatisk reaktionsovervågning. Der er en række klikaktiverede forløbere, der er tilgængelige via enkle syntetiske ruter eller kan købes, der kan inkorporeres i enzymreaktioner. Disse reaktioner udføres typisk i rekombinante systemer, selvom cellebaserede assays også er mulige22. Fordelen ved klikaktiverede co-faktorer og substrater er, at screening direkte kan måle enzymaktivitet uden behov for koblede udlæsningssystemer, der ofte forstyrres af screeningsforbindelser og kræver yderligere håndteringstrin. Dette tillader kun inhibitorbehandlinger under det enzymatiske trin, mens alle nedstrøms funktionaliserings- og detektionstrin udføres efter omfattende vask for at fjerne forbindelser, hvilket begrænser potentialet for assayinterferens. Disse fordele gør designet af klikaktiverede assays at foretrække frem for koblede assays, der almindeligvis er afhængige af påvisning af frit coenzym A.

En vigtig overvejelse er accepten af klikaktiverede co-faktorer i enzymets aktive site. Eksisterende klikaktiverede cofaktorer er muligvis ikke fuldt kompatible med det aktive website, der er optimeret til den oprindelige cofaktor. Strukturel information og modellering kan bruges til at designe aminosyresubstitutioner for at forstørre det aktive sted for at inkorporere ændrede substrater23. Dette kan muliggøre screening med forbedret enzymkinetik og lavere substrat- og enzymniveauer. Ulempen ved denne fremgangsmåde er, at ændrede katalytiske lommer muligvis ikke identificerer hæmmere, der interagerer stærkt med det oprindelige enzym. I sidste ende kræves en kombination af tilgange for at identificere og validere potentielle enzymhæmmere.

Her beskriver vi en metode udviklet til at oprense og assay HAT1-enzymaktivitet ved hjælp af klik-co-faktor 4-pentynoyl-CoA24. Dette assay (figur 1) bruger den oprindelige enzymsekvens i kompleks med dets krævede partnerprotein Rbap46, som har vist sig at øge enzymaktiviteten. Oprensning af enzymet fra humane celler muliggør enzymaktivering i cellulo, hvilket kan bevare stimulerende posttranslationelle modifikationer, der er vigtige for fuld enzymaktivitet. Design og optimering af rekombinante enzymassays til kemiske skærme med høj kapacitet er med succes blevet brugt til at identificere og karakterisere HAT1 små molekylehæmmere.

Protocol

1. Metode 1: Fremstilling og rensning af rekombinant HAT1/Rbap46-kompleks Optøning, gendannelse og udvidelse af HEK293f-cellerOptø 1-10 millioner HEK293f pattedyrceller26 i 30 ml freestyle 293 ekspressionsmedier i en 100 ml kolbe. Der inkuberes i 8 % CO2 ved 37 °C, mens der roteres ved 60 omdr./min. Den næste dag skal du tælle og kontrollere cellelevedygtigheden og derefter justere rotationshastigheden til 120 o / min. Udvid til 300 ml …

Representative Results

Standardkurver i to eksemplarer (16 huller) skal medtages på hver plade for at sikre korrekt analyseydelse. Standardkurvedata bør opstilles i tabelform med et interval på 100% til 0% i henhold til forholdet mellem Pra-holdigt peptid og naturligt H4-peptid i opløsning (tabel 1). Amplex rødt signal vil være det højeste i 100% pra/0% native H4 peptidbrønde, og lavest i 0% pra/100% native H4 peptidbrønde. Efter fluorescens er detekteret, og brønde er gennemsnitlige, skal den resulterende standardgr…

Discussion

I det sidste årti blev klikkemi fremtrædende20, hvilket muliggør præcis design af interagerende kemiske strukturer. Inden for denne sammenhæng har forskellige bioortogonale kovalente forbindelser21 vist sig som lovende muligheder for dannelse af komplekser i deres naturlige miljø. Klikkemi anvender par af funktionelle grupper, der udviser hurtige og selektive reaktioner, almindeligvis kendt som “klikreaktioner”. Disse reaktioner forekommer effektivt under miljøvenlig…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Vi takker George Zheng for at levere H4K12CoA. Vi takker medlemmer af Gruber Lab for nyttige diskussioner og feedback. Vi takker støtten fra NIH/NCI (1K08CA245024), CPRIT (RR200090) og V Foundation (V2022-022).

Materials

4P CoA Cayman Chemical 10547 Click chemistry co-factor
Amplex Red Fisher Sci A12222 Fluorescence substrate
Biotin-PEG-Azide Alfa Aesar J64996MC Click chemistry
Copper Sulfate Sigma-aldrich  7758-98-7 Click chemistry
DMSO Fisher Scientific  67-68-5 diluent
DTT Acros Organics 03-12-3483 reducting agent
Forskolin VWR 102987-310 Protein expression
Freestyle 293 Expression Medium Thermo Fisher 12338018 Media
Freestyle 293-F cells Thermo Fisher R790-07 Protein expression
H4-peptide/1-23-GGK-biotin Anaspec AS65097 peptide substrate
HEPES Sigma-aldrich  7365-45-9 EB buffer
Hydrogen peroxide 30% solution Sigma-aldrich  Z00183-99-0 initiator
M2 FLAG antibody slurry Millipore-Sigma A2220 Protein purification
Macrosep 10K Filter (Pall Lab) VWR 89131-980 Protein purification
Neutravidin Plate Thermo Sci 15127 BSA-pre-blocked
NP40 (IGEPAL) MP Biomedical 198596 20x buffer
pHEK-293 plasmid Takara Bio 3390 Protein expression
Phosphate Buffered Saline 10x Alfa Aesar  Z00082-33-6 wash buffer
Pra peptide Genscript Custom synthesis biotinylated
Sodium Ascorbate Sigma-aldrich  134-03-2 Click chemistry
Sodium chloride Sigma-aldrich  7647-14-5 EB buffer
Sodium phosphate VWR International 7558-80-7 buffer
Streptavidin EMD Millipore 189730 competitor
Streptavidin-HRP Cell Signaling 3999S enzyme
THPTA ligand Fisher Sci 1010-500 Click chemistry
Tris base Sigma-aldrich  77-86-1 20x buffer
Triton-X 100 VWR International  9002-93-1 EB buffer
Tween-20 Sigma-aldrich  9005-64-5 Wash buffer
Urea Sigma-Aldrich 57-13-6 quencher

References

  1. Kleff, S., et al. Identification of a gene encoding a yeast histone H4 acetyltransferase. J Biol Chem. 270 (42), 24674-24677 (1995).
  2. Parthun, M. R., Widom, J., Gottschling, D. E. The major cytoplasmic histone acetyltransferase in yeast: links to chromatin replication and histone metabolism. Cell. 87 (1), 85-94 (1996).
  3. Verreault, A., et al. Nucleosomal DNA regulates the core-histone-binding subunit of the human Hat1 acetyltransferase. Curr Biol. 8 (2), 96-108 (1998).
  4. Parthun, M. R. Histone acetyltransferase 1: more than just an enzyme. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 256-263 (2013).
  5. Gruber, J. J., et al. HAT1 coordinates histone production and acetylation via H4 promoter binding. Mol Cell. 75 (4), 711-724 e5 (2019).
  6. Fan, P., et al. Overexpressed histone acetyltransferase 1 regulates cancer immunity by increasing programmed death-ligand 1 expression in pancreatic cancer. J Exp Clin Cancer Res. 38 (1), 47 (2019).
  7. Xia, P., et al. MicroRNA-377 exerts a potent suppressive role in osteosarcoma through the involvement of the histone acetyltransferase 1-mediated Wnt axis. J Cell Physiol. 234 (12), 22787-22798 (2019).
  8. Yang, G., et al. Histone acetyltransferase 1 is a succinyltransferase for histones and non-histones and promotes tumorigenesis. EMBO Rep. 22 (2), e50967 (2021).
  9. Xue, L., et al. RNAi screening identifies HAT1 as a potential drug target in esophageal squamous cell carcinoma. Int J Clin Exp Pathol. 7 (7), 3898-3907 (2014).
  10. Zhang, W., et al. Structural plasticity of histones H3-H4 facilitates their allosteric exchange between RbAp48 and ASF1. Nat Struct Mol Biol. 20 (1), 29-35 (2013).
  11. Campos, E. I., et al. The program for processing newly synthesized histones H3.1 and H4. Nat Struct Mol Biol. 17 (11), 1343-1351 (2010).
  12. Agudelo Garcia, P. A., et al. Identification of multiple roles for histone acetyltransferase 1 in replication-coupled chromatin assembly. Nucleic Acids Res. 45 (16), 9319-9335 (2017).
  13. Nagarajan, P., et al. Histone acetyl transferase 1 is essential for mammalian development, genome stability, and the processing of newly synthesized histones H3 and H4. PLoS Genet. 9 (6), e1003518 (2013).
  14. Annunziato, A. T. Assembling chromatin: the long and winding road. Biochim Biophys Acta. 1819 (3-4), 196-210 (2013).
  15. Annunziato, A. T., Seale, R. L. Histone deacetylation is required for the maturation of newly replicated chromatin. J Biol Chem. 258 (20), 12675-12684 (1983).
  16. Dahlin, J. L., et al. Assay interference and off-target liabilities of reported histone acetyltransferase inhibitors. Nat Commun. 8 (1), 1527 (2017).
  17. Baell, J. B., Miao, W. Histone acetyltransferase inhibitors: where art thou. Future Med Chem. 8 (13), 1525-1528 (2016).
  18. Lasko, L. M., et al. Discovery of a selective catalytic p300/CBP inhibitor that targets lineage-specific tumours. Nature. 550 (7674), 128-132 (2017).
  19. Baell, J. B., et al. Inhibitors of histone acetyltransferases KAT6A/B induce senescence and arrest tumour growth. Nature. 560 (7717), 253-257 (2018).
  20. Falk, H., et al. An efficient high-throughput screening method for MYST family acetyltransferases, a new class of epigenetic drug targets. J Biomol Screen. 16 (10), 1196-1205 (2011).
  21. He, M., et al. Chemical biology approaches for investigating the functions of lysine acetyltransferases. Angew Chem Int Ed Engl. 57 (5), 1162-1184 (2018).
  22. Lipchik, A. M., et al. A peptide-based biosensor assay to detect intracellular Syk kinase activation and inhibition. Biochemistry. 51 (38), 7515-7524 (2012).
  23. Song, J., et al. Chemoproteomic profiling of protein substrates of a major lysine acetyltransferase in the native cellular context. ACS Chem Biol. 17 (5), 1092-1102 (2022).
  24. Gaddameedi, J. D., et al. Acetyl-click screening platform identifies small-molecule inhibitors of histone acetyltransferase 1 (HAT1). J Med Chem. 66 (8), 5774-5801 (2023).
  25. Ngo, L., Brown, T., Zheng, Y. G. Bisubstrate inhibitors to target histone acetyltransferase 1 (HAT1). Chem Biol Drug Des. 93 (5), 865-873 (2019).
  26. Parker, C. G., Pratt, M. R. Click chemistry in proteomic investigations. Cell. 180 (4), 605-632 (2020).
  27. Islam, K. The bump-and-hole tactic: Expanding the scope of chemical genetics. Cell Chem Biol. 25 (10), 1171-1184 (2018).
  28. Radziwon, K., Weeks, A. M. Protein engineering for selective proteomics. Curr Opin Chem Biol. 60, 10-19 (2021).
  29. Rich, R. L., Myszka, D. G. Survey of the year 2007 commercial optical biosensor literature. J Mol Recognit. 21 (6), 355-400 (2008).

Play Video

Cite This Article
Rajkumar, S., Dixon, D., Lipchik, A. M., Gruber, J. J. An Acetyl-Click Chemistry Assay to Measure Histone Acetyltransferase 1 Acetylation. J. Vis. Exp. (203), e66054, doi:10.3791/66054 (2024).

View Video