Automatically Generated

Summary

Denne protokollen foreslår helhetlige laboratorieprosedyrer som kreves for å oppdage enkeltnukleotidpolymorfismer i magekreftprøver basert på en ionehalvledersekvenseringsplattform. Målsekvensene, ligeringsadaptere, bibliotekforsterkning og rensing, og kvalitetskontrollkriterier er også beskrevet i detalj.

Abstract

Magekreft er en vanlig heterogen svulst. De fleste pasienter har avansert magekreft på diagnosetidspunktet og trenger ofte cellegift. Selv om 5-fluorouracil (5-FU) er mye brukt til behandling, må dens terapeutiske sensitivitet og legemiddeltoleranse fortsatt bestemmes, noe som understreker viktigheten av individualisert administrering. Farmakogenetikk kan veilede den kliniske implementeringen av individualisert behandling. Enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP), som en genetisk markør, bidrar til valg av passende kjemoterapiregimer og doser. Noen SNP-er er assosiert med folatmetabolisme, det terapeutiske målet for 5-FU. Metylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) rs1801131 og rs1801133, dihydrofolatreduktase (DHFR) rs1650697 og rs442767, metioninsyntase (MTR) rs1805087, gamma-glutamylhydrolase (GGH) rs11545078 og oppløst stoffbærerfamilie 19 medlem 1 (SLC19A1) rs1051298 har blitt undersøkt i forskjellige typer kreftformer og antifolatantitumormedisiner, som har potensiell prognose og veiledende betydning for anvendelse av 5-FU. Ionetorrentens neste generasjons halvledersekvenseringsteknologi kan raskt oppdage magekreftrelaterte SNP-er. Hver gang en base utvides i en DNA-kjede, vil en H⁺ frigjøres, noe som forårsaker lokale pH-endringer. Den ioniske sensoren oppdager pH-endringer og konverterer kjemiske signaler til digitale signaler, og oppnår sekvensering ved syntese. Denne teknikken har lavt prøvekrav, enkel betjening, lave kostnader og rask sekvenseringshastighet, noe som er gunstig for å veilede individualisert kjemoterapi av SNP-er.

Introduction

Magekreft er en tung belastning innen global folkehelse. I følge Global Cancer Statistics 2020, utgitt av International Agency for Research on Cancer (IARC), er magekreft den femte mest diagnostiserte kreften og den fjerde ledende årsaken til kreftrelatert død. På verdensbasis er forekomsten av aldersstandardisert rate i Øst-Asia høyest hos både menn og kvinner¹. Forekomsten av magekreft er snikende, noe som betyr at pasienter ofte ikke har noen åpenbare og spesifikke symptomer i det tidlige stadiet. Blant alle magekreftpasienter, i land uten rutinemessig screening, blir 80%-90% av pasientene enten diagnostisert på et avansert stadium når svulsten ikke kan opereres eller får tilbakefall innen 5 år etter operasjonen².

For avansert eller metastatisk magekreft er cellegift hovedbehandlingen, som kan forbedre overlevelsesraten og livskvaliteten til pasientene. For den første behandlingen av pasienter med metastatisk magekreft er et platina-fluoropyrimidinregime hovedvalget for et førstelinjekjemoterapeutisk regime³. Fluoropyrimidin inkluderer hovedsakelig 5-fluorouracil (5-FU) og orale fluoropyrimidinderivater, som kapecitabin og tegafur. Hovedmålet for 5-FU er folatmetabolismerelaterte enzymer, som hemmer DNA-syntese og bremser veksten av tumorvev. Bivirkninger begrenser nytten, med diaré, mukositt, myelosuppresjon og hånd-fot-syndrom blant de hyppigste bivirkningene. Det er rapportert at terapeutisk respons og bivirkninger er nært knyttet til faktorer i folatmetaboliseringsveien. Spesielt har den homozygote mutasjonen av rs1801131 blitt identifisert som en indikator for hånd-fot-syndrom (p = 4,1 x ^10-6, OR =9,99, 95 % KI: 3,84-27,8)⁴. Selv om fluoropyrimidiner er mye brukt i kjemoterapi mot kreft, er deres kjemoresistens en vanlig nødsituasjon, noe som forårsaker terapeutisk svikt i magekreftbehandling. For eksempel er den totale responsraten bare 10%-15% blant pasienter med avansert kolorektal kreft behandlet med 5-FU bare⁵. Fluoropyrimidiner har også toksisitet som ikke kan ignoreres. Toksisitetsreaksjonene indusert av 5-FU inkluderer hovedsakelig diaré, hånd-fot-syndrom, stomatitt, nøytropeni, trombocytopeni, nevrotoksisitet og til og med død⁶. Alvorlig behandlingsrelatert toksisitet forekommer hos 10%-30% av pasientene behandlet med fluoropyrimidiner, og dødelig toksisitet forekommer hos 0,5%-1% av disse pasientene⁷.

En livskvalitetsstudie av pasienter med avansert magekreft fant at responsraten var mindre enn 50 % for de som fikk 5-FU-basert kjemoterapi⁸. Derfor er det spesielt viktig å forstå faktorene knyttet til følsomheten til 5-FU-basert kjemoterapi for presis behandling for å maksimere responsraten og effektiviteten samtidig som toksisiteten minimeres. Tatt i betraktning at 5-FU er nært beslektet med folatmetabolismen, kan de genetiske variantene av enzymer i folatmetabolske vei være en av faktorene. Omtrent 90 % av menneskelig sekvensvariasjon tilskrives enkeltbasemutasjoner i DNA, kjent som enkeltnukleotidpolymorfismer (SNP)⁹. Når SNP-er endrer enzymegenskapene til folatmetabolismen, kan det føre til individuelle forskjeller i effekt, toksisitet og kjemoresistens mot fluorouracil hos magekreftpasienter.

Metylentetrahydrofolatreduktase (MTHFR) brukes hovedsakelig til å omdanne 5,10-metylentetrahydrofolat (5,10-MTHF) til 5-metyltetrahydrofolat. 5-FdUMP, en metabolitt av 5-FU, danner inaktiv ternær med 5,10-MTHF og tymidylatsyntase (TS), hemmer aktiviteten til TS og fører til mangel på dTMP¹⁰. Akkumulering av 5,10-MTHF kan forsterke hemmingseffekten av 5-FU på TS, som er korrelert med aktiviteten til MTHFR. MTHFR rs1801131 og rs1801133 er de vanligste polymorfismene, som er relatert til lavere enzymaktivitet (en reduksjon på 75 % for rs1801133 og 30 % for rs181131) og akkumulering av 5,10-MTHF¹¹.

Dihydrofolatreduktase (DHFR) er nøkkelenzymet i folatmetabolisme og DNA-syntese. DHFR reduserer dihydrofolat, ved hjelp av NADPH, til tetrahydrofolat (THF) som brukes til å bære en karbonenhet. SNP-er av DHFR kan påvirke ekspresjonen, endre aktiviteten og overfloden av THF, og ytterligere påvirke folatmetabolismen og følsomheten til 5-FU. DHFR rs1650697 punktmutasjon forekommer i den viktigste promotoren til DHFR-genet, noe som øker DHFR-uttrykket¹². En studie fant at rs442767 er assosiert med effekten og toksisiteten til antifolat antitumormedisiner, som pemetreksed og metotreksat. Når det gjelder SNP rs442767, betyr en GT-genotype arven av en G-allel og en T-allel på samme sted på de homologe kromosomene fra hver forelder. På samme måte betegner genotypene GG og TT arven av enten to G-alleler eller to T-alleler, tilsvarende. Sammenliknet med genotype GT+TT er GG relatert til redusert hendelsesfri overlevelse og økt risiko¹³. Dette antyder at rs442767 kan føre til viss potensiell innflytelse på 5-FU.

Metioninsyntase (MTR) katalyserer re-metylering av homocystein til metionin, som spiller en viktig rolle i folatmetabolismen. MTR rs1805087 er den vanligste polymorfismen til MTR-genet . MTR rs1805087 erstatter asparaginsyre med glycin på det potensielt funksjonelle stedet for protein, noe som kan redusere aktiviteten til MTR. Forsøkspersoner med G-allelet hadde økt folatnivå i plasma og redusert homocysteinnivå¹⁴ i plasma. Tvert imot viste en studie at rs1805087 ikke har noen statistisk signifikant sammenheng med effekten av 5-FU. Men denne studien fokuserte på tykktarmskreft og utvalgsstørrelsen var liten. Forholdet mellom rs1805087 og effekten av 5-FU hos magekreftpasienter gjenstår å utforske¹⁵.

Gamma-glutamylhydrolase (GGH) er et lysosomal enzym som regulerer intracellulære folatkonsentrasjoner. Pteroylglutaminsyre er synonymet med folsyre som består av pterin, p-aminometylbenzoesyre og glutaminsyre. Det er to former for folsyre i organismer, monoglutamat folat og polyglutamert folat. THF-polyglutamat omdannes enzymatisk til monoglutaminfolat av GGH, og frigjør suksessivt enten mono-glutamat (mono-glu) eller di-glutamat (di-glu)¹⁶. En studie om GGH-ekspresjon hos pasienter med lokalt avansert magekreft, viste at høyt GGH-uttrykk kunne redusere 5,10-MTHF og TS, noe som betyr at bare en liten dose 5-FU er nødvendig for å oppnå den TS-hemmende effekten hos disse pasientene¹⁷. GG er en prognostisk biomarkør hos pasienter med lokalt avansert magekreft behandlet med postoperativ adjuvant kjemoterapi med S-1, et prodrug av 5-FU, og spiller en viktig rolle i å opprettholde intracellulær homeostase av folsyre¹⁸. GGH rs11545078 er missense-variant og endrer Thr-127 til Ile-127. En studie som fokuserer på substratspesifisitet til GGH antyder at rs11545078, sammenlignet med villtype, resulterer i høyere Km og lavere katalytisk effektivitet for metotreksat, og strukturen ligner på folsyre¹⁹. Sammen er det å utforske forholdet mellom rs11545078 og kliniske resultater av 5-FU en lovende strategi for å forstå legemiddelresistens.

Solute bærerfamilie 19 medlem 1 (SLC19A1), også kalt redusert folattransportør, er et typisk tilretteleggende transmembranprotein som importerer reduserte folater som pattedyrceller mangler evnen til de novo syntetiserer, noe som er anerkjent for å estimere responsen til svulst til 5-FU²⁰. Imidlertid er det bare utført noen få studier angående sammenhengen mellom 5-FU og SLC19A1 polymorfisme²¹. Hos pasienter med ikke-småcellet lungekreft som fikk pemetreksed, som er en folatanalog, bidro rs1051298 på SLC19A1-genet til å øke risikoen for alle bivirkninger og redusere total overlevelse^22,23. SLC19A1 rs1051298, en 3’uoversatt regionvariant om folatmetabolisme, kan bidra til å forklare noen av de individuelle forskjellene om 5-FU-terapi. Her er målet å evaluere sammenhengen mellom rs1051298 og 5-FU-resistens blant pasienter med magekreft.

Et sett, basert på halvledersekvensering, brukes til kvalitativ gendeteksjon in vitro (figur 1), som kan oppdage 7 utvalgte SNP-er i 5 gener, rs1801131 og rs1801133 mutasjoner av MTHFR-genet , rs1650697 og rs442767 mutasjoner av DHFR-genet , rs1805087 mutasjon av MTR-genet , rs11545078 mutasjon av GGH-genet og rs1051298 av SLC19A1 i tumorvevsprøver fra magekreftpasienter. Først ble prøvenukleinsyren ekstrahert, og målfragmentet ble spesifikt amplifisert ved PCR. En universell sekvenseringsadapter ble lagt til i begge ender av DNA-fragmentet for å konstruere et bibliotek som kan brukes til sekvensering. Deretter ble det gjort forsterkning av sekvenseringsbiblioteket med PCR for å danne en sekvenseringsmal. Den positive malen ble beriket for å oppfylle sekvenseringskravene. Ved å bruke halvledersekvenseringssystemet, ved å feste DNA-strengen i det lille hullet på halvlederbrikken. DNA-polymerase tar det enkelttrådede DNA-et som mal og syntetiserer den komplementære DNA-strengen i henhold til prinsippet om komplementær baseparing. Hver gang en base forlenges i en DNA-kjede, vil et proton frigjøres, noe som forårsaker lokale pH-endringer. En ionisk sensor oppdager pH-endringer og konverterer kjemiske signaler til digitale signaler, slik at baser kan tolkes i sanntid, og til slutt kan basesekvensen til hvert DNA-segment oppnås. Bioinformatikkanalyse ble brukt for å matche disse sekvensene til referansekartet over det menneskelige genomet. Når magekreftrelaterte gener muterer, vil deres tilsvarende DNA-basesekvenser endres, for å få mutasjonsinformasjonen til relaterte gener.

Resultatet kan vise genmutasjonsstatus og gi referanse for klinikere til å velge passende typer og doser av cellegiftmedisiner og forutsi medikamentresistens for magekreftpasienter. Testresultatene er imidlertid kun til klinisk referanse og anbefales ikke å være det eneste grunnlaget for individualisert behandling av pasienter. Klinikere bør gjøre en helhetlig vurdering basert på pasientens tilstand, legemiddelindikasjoner, behandlingsreaksjoner og andre laboratorietestindikatorer.

Protocol

Alle protokoller og vevsprøver av magekreft (trinn 1), hentet fra øvre gastrointestinal endoskopi eller kirurgi, brukt i denne studien ble gjennomgått og godkjent av medisinsk etisk komité 24. Dessuten er denne protokollen designet utelukkende for å illustrere multigendeteksjon ved magekreft uten å delta i kohortsammenligninger, derfor pålegger den ingen spesifikke kriterier for å inkludere eller ekskludere pasienter. Pasientene/deltakerne ga sitt skriftlige informerte samtykke til å delta i denne studien. 1. Fremstilling av innebygde blokker av magekreft Konfigurer vevsinnbyggingssystemet, som består av et parafinreservoar og dispenser, sammen med varme og kalde plater, i henhold til de foreskrevne driftsretningslinjene. Trekk ut det forberedte vevet for innstøping fra dehydratoren og legg det inn i innstøpingssenterets oppbevaringsspalte. Velg passende støpeformer basert på vevsstørrelsen, hell nok mengde smeltet parafin til å dekke vevet, og plasser deretter formen på den varme platen. Hent vevet fra kassettene og plasser mageslimhinnen vinkelrett på bunnen av innstøpingsformen for å sikre at tverrsnittsplanet skjærer gjennom alle vevslag. Juster vevet i formen. Sett kassetten på toppen av formen, etterfulgt av en sekundær helling av parafin, og fyll formen. Plasser den innebygde formen på den kalde platen, og etter parafinens størkning, knips av de innebygde blokkene fra formene. 2. Ekstraksjon av nukleinsyre fra prøver Bruk nukleinsyreekstraksjons- og rensesett for å trekke ut nukleinsyrer fra parafininnstøpte vevsprøver. Bruk en nukleinsyrekvantifikator for å kvantifisere den ekstraherte nukleinsyren. Nukleinsyrekonsentrasjonen anbefales å være større enn 2 ng/μL.MERK: Materialene som brukes her, er tilgjengelige i materialoversikten. 3. Forberedelse til sekvenseringsbibliotek Forberedelse før eksperimentSlå PÅ UV-lampen i den ultrarene arbeidsbenken, steriliser i 30 minutter. Slå deretter AV UV lamp og slå PÅ viften for å ventilere i 10 minutter. Ta nukleinsyren ut av -20 ± 5 °C. kjøleskap, sjekk og registrer sample ID, nukleinsyre strekkode og spesifikk etikett tag nummer tildelt sample. Sett den på sentrifugerørstativet for oppløsning ved romtemperatur (RT) etter verifisering, og sentrifuger den i 10 s, med faste 2,500 x g for standby. PCR-amplifikasjon av målfragmentTa fragmentfangstreaksjonsløsningen, amplifikasjonsprimeren for magekreft og fusjonsamplifikasjonsprimeren fra det skreddersydde multigendeteksjonssettet for magekreft og legg dem på is for smelting. Rist og bland dem etter smelting, sentrifuger dem i 10 s, og tilbered nukleasefritt vann. Detaljert primerinformasjon er vist i tabell 1.NOTAT: Settet er ikke kommersielt tilgjengelig ennå, kontakt forfattere for mer informasjon. Forbered et 0,2 ml PCR-reaksjonsrør, tilsett reagenser i røret etter tur i henhold til tilleggstabell 1, virvel og bland i 5 s, og sentrifuger øyeblikkelig i 10 s, med faste 2,500 x g, slik at det ikke er noen åpenbare dråper på rørveggen og dekselet. RNA-prøver skal reverseres transkribert til cDNA og deretter brukes til påfølgende bibliotekkonstruksjon. cDNA-produkter skal tilsettes rørene etter tur i henhold til tilleggstabell 2. Plasser hvert reaksjonsrør på den termiske syklisten. For DNA-prøvene, kjør amplifikasjonsprogrammet som beskrevet i tabell 2. For cDNA-produkter, kjør amplifikasjonsprogrammet som beskrevet i tabell 3. Fordøyelse av primersekvensTa ut primerfordøyelsesenzymet og legg det på is for smelting. Etter amplifikasjon, ta ut reaksjonsrørene ovenfor, tilsett 2 μL primerfordøyelsesenzym til hvert rør, og sørg for at det totale volumet er 22 μL. Virvel og bland reaksjonsløsningen i PCR-røret og sentrifuger øyeblikkelig i 10 s, med faste 2,500 x g. Sett hvert reaksjonsrør på den termiske syklisten og kjør programmet som beskrevet i tabell 4. Ligering av adapterSett adapteren som kobler reagensene på is for å løse opp. Forbered 1.5 ml mikrosentrifugerør, og bland deretter hver komponent i henhold til tabell 5, og merk den som adapterblanding X.NOTAT: Adaptertilkoblingsreagensene inkluderer P1-adaptere og spesifikke adaptere X, nummerert 1 til 48. Disse er designet for å unikt merke ulike prøver. Når du legger til en spesifikk adapter, må du bare åpne ett rør om gangen for å forhindre krysskontaminering av den spesifikke adapteren. Den fortynnede spesifikke adapterblandingen kan lagres ved -20 ± 5 °C for standby. I sekvenseringsarbeidsflyter behandles ikke eksempler individuelt, men flere eksempler, hver merket med en bestemt adapter, kombineres til et enhetlig bibliotek for sekvensering. Denne metoden muliggjør påfølgende differensiering av prøver basert på deres spesifikke adaptersekvenser. Ta ut det fordøyde grunningsproduktet (22 μL) fra den termiske syklisten. Tilsett reagenser i røret etter tur i henhold til tabell 6, virvel og bland i 5 s. Sentrifuger med lav hastighet i 10 s, med faste 2,500 x g, slik at det ikke er noen åpenbar dråpe på veggen og dekselet til røret. Plasser reaksjonsrøret på den termiske syklisten. For DNA-prøvene, kjør amplifikasjonsprogrammet som beskrevet i tabell 7. For cDNA-produkter, kjør amplifikasjonsprogrammet som beskrevet i tabell 8. Rensing av ligeringsprodukt og forsterkningTa de magnetiske perlene for DNA-rensing ut av kjøleskapet på 2-8 °C på forhånd, virvel dem jevnt og sentrifuger dem øyeblikkelig i 10 s, med faste 2 500 x g. Balanser de magnetiske perlene ved RT i 30 min. Forbered et 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav adsorpsjon og overfør produktet av ligeringsreaksjonen til det tilsvarende røret. Tilsett 45 μL DNA-rensede magnetiske perler i hvert rør, virvel og bland godt, sentrifuger øyeblikkelig i 10 s, og inkuber ved RT i 5 minutter. Plasser røret på et magnetisk stativ i 3 minutter. Kast supernatanten og unngå å pipettere perlene ut. Overfør 300 μL nytilberedt 75 % etanol inn i mikrosentrifugerøret, og roter rørene forsiktig 4 ganger ved 180 °. Etter at løsningen er klar, kast supernatanten raskt. Unngå å pipettere perlene ut. Gjenta vaskeprosedyren 1 ganger til. Fjern 1.5 ml mikrosentrifugerørene fra magnetstativet, og sentrifuger kort (10 s, med faste 2,500 x g). Sett rørene tilbake i magnetstativet og pipetterer ut den gjenværende væsken. Sørg for at det ikke er rester av væske på rørveggen. Åpne lokket på hvert 1,5 ml mikrosentrifugerør og tørk perlene ved RT i 5 minutter. Vær oppmerksom på den tørre og våte tilstanden til perlene. Etter at de magnetiske perlene er tørket, sjekk for ingen vannflekker på overflaten. Forleng tørketiden riktig hvis magnetperlene er for våte. Lukk lokket umiddelbart hvis det oppstår sprekker på perlene, og fortsett neste trinn for å forsterke og rense biblioteket. Forsterkning og rensing av bibliotekLegg PCR-relaterte reagenser på is for oppløsning på forhånd, virvel dem og sentrifuger dem i 10 s. Fjern 1.5 ml mikrosentrifugerøret fra magnetstativet, pipetter PCR-regentene inn i røret i henhold til tabell 9 og lukk hetten og virvelen i 5 sekunder. Sentrifuger kort (10 s) for å få ingen åpenbar væskedråpe på rørveggen og dekselet. Overfør produktet ovenfor til et nytt PCR-rør. Inkuber prøven på en termisk syklist. For DNA-prøvene, kjør amplifikasjonsprogrammet som beskrevet i tabell 10. For cDNA-produkter, kjør amplifikasjonsprogrammet som beskrevet i tabell 11. Forbered et nytt 1,5 ml mikrosentrifugerør med lav adsorpsjon. Sentrifuger PCR-røret i 10 s etter inkubasjon. Overfør produktet fra PCR-røret til EP-røret. Tilsett 25 μL DNA-rensede magnetiske perler i hvert rør. Virvel og bland godt, sentrifuger ved lav hastighet og inkuber ved RT i 5 min. Plasser rørene på et magnetisk stativ i 3 minutter og vent til løsningen blir klar. Overfør supernatanten til nye mikrosentrifugerør. Unngå å pipettere perlene ut. Tilsett 60 μL DNA-rensede magnetiske perler i hvert rør. Virvel og bland godt, sentrifuger ved lav hastighet og inkuber ved RT i 5 min. Plasser rørene på et magnetisk stativ i 3 minutter og vent til løsningen blir klar. Kast supernatanten. Unngå å pipettere perlene ut. Overfør 300 μL av den nytilberedte 75 % etanolen inn i rørene, og roter rørene forsiktig 4x ved 180°. Etter at løsningen er klar, pipetterer du raskt og kaster supernatanten. Unngå å pipettere perlene ut. Gjenta vaskeprosedyren 1x. Fjern 1.5 ml mikrosentrifugerørene fra magnetstativet, og sentrifuger kort (10 s). Sett rørene tilbake i det magnetiske stativet og pipetterer ut den gjenværende væsken. Sørg for at det ikke er rester av væske på rørveggen. Åpne hettene på 1,5 ml rør og tørk perlene ved RT i 5 minutter. Vær oppmerksom på den tørre og våte tilstanden til perlene. Etter at de magnetiske perlene er tørket, er det ingen vannflekker på overflaten. Forleng tørketiden riktig hvis magnetperlene er for våte. Lukk lokket umiddelbart hvis det oppstår sprekker på perlene. Pipetter 50 μL elueringsmiddel i rørene, virvel og bland godt. Sentrifuger kort (5 s, med faste 2,500 x g) og plasser rørene på RT i 5 min. Plasser rørene på et magnetisk stativ i 3 minutter og vent til løsningen blir klar. Fjern væsken forsiktig i et nytt rør og merk biblioteknavnet. Oppbevar biblioteket midlertidig i kjøleskap ved 2-8 °C og vent på kvantitativ bestemmelse eller oppbevar biblioteket i kjøleskap ved -20 ± 5 °C for langtidslagring. 4. Kvantifisering av det konstruerte biblioteket Bruk nukleinsyrekvantifikatoren til å kvantifisere biblioteket. Hvis bibliotekkonsentrasjonen er ≥ 0,2 ng/μL, er den kvalifisert. Ellers kan du bygge biblioteket på nytt. Bland like volum DNA (eller RNA) og kvantifiser løsningen. I henhold til det kvantitative resultatet, fortynn den blandede løsningen til 100 pmol/L ved å bruke følgende formel.MERK: Et alternativ er å fortynne biblioteket til 100 pmol/L i henhold til formelen, og deretter kvantifisere med fluorescerende kvantitativ PCR. Bland DNA(eller RNA)-biblioteker likt i henhold til kvantitative resultater fra PCR-instrumentet. Bland 100 pmol/L DNA-bibliotek og RNA-bibliotek i forholdet 4:1. Bruk den blandede løsningen av DNA- og RNA-biblioteket for datasekvensering. 5. Sekvensering Utfør sekvensering ved å referere til manualen til det universelle settet med sekvenseringsreaksjon24,25 (halvledersekvenseringsmetode). 6. Kvalitetskontroll av prøver Positiv kvalitetskontroll av magekreft-DNA: Ta DNA-positiv kontroll av magekreft og utfør testen i henhold til instruksjonene i settet. Kontrollen følger med settet. Resultatet viser at MTHFR, DHFR, MTR, GGH og SLC19A1 genmutanter påvises. Negativ kvalitetskontroll av magekreft-DNA: Ta DNA-negativ kontroll av magekreft og utfør testen i henhold til instruksjonene i settet. Kontrollen følger med settet. Resultatet viser at de ville typene av MTHFR, DHFR, MTR, GGH og SLC19A1 gener påvises.NOTAT: Sørg for at kriteriene er oppfylt i begge tilfellene, ellers er det nødvendig med ny gjenkjenning. 7. Dataanalyse Kjør den tilsvarende plugin-modulen (Variant Caller, Coverage Analysis og Ion Reporter Software) i Torrent Suite-programvaren for å få analyseresultatene av prøvene. Bedøm prøvedeteksjonsresultatene i henhold til analyseresultatene til plugin-modulen.

Representative Results

Bestemmelsen av testresultater er avhengig av den positive vurderingsverdien, som også anerkjennes som referanseintervallet. Bruk halvledersekvenseringsmetode for å oppdage de innsamlede kliniske prøvene. Når mutasjonsfrekvensverdien til MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH – og SLC19A1-gener er ≥ 5 %, er deteksjonsresultatet mutanten av tilsvarende gen. Når mutasjonsfrekvensverdien er < 5 %, er deteksjonsresultatet villtypen av det tilsvarende genet26. Følgende kriterier kan brukes til å avgjøre om deteksjonsresultatene er troverdige. For det første, hvis den gjennomsnittlige dekningen av DNA-sekvenseringsresultater er ≥ 500, og de kartlagte avlesningene av RNA-sekvenseringsresultater er ≥ 20000, er testresultatene troverdige27. Ellers anbefales det å teste på nytt. For det andre er den gjennomsnittlige dekningen av DNA-positiv kvalitetskontroll av magekreft ≥ 500, og testresultatet skal være i samsvar med rs1801131 og rs1801133 mutasjoner av MTHFR-genet , rs1650697 og rs442767 mutasjoner av DHFR-genet , rs1805087 mutasjon av MTR-genet , rs11545078 mutasjon av GGH-genet og rs1051298 mutasjon av SLC19A1 genet som positivt. Ellers anbefales det å teste på nytt. For det tredje er den gjennomsnittlige dekningen av DNA-negativ kvalitetskontroll av magekreft ≥ 500, og deteksjonsresultatene skal vise at alle stedene innenfor deteksjonsområdet til dette settet er villtype. Ellers anbefales det å teste på nytt. Til slutt er bibliotekkonsentrasjonen lavere enn 0,2 ng/μL, noe som kan skyldes nedbrytning av DNA eller RNA i prøven, eller unnlatelse av å følge den eksperimentelle prosessen eller bruk av utgåtte reagenser under eksperimentet. Ovennevnte forhold kan føre til at sekvenseringskvaliteten synker eller svikter. Det anbefales å gjenoppbygge biblioteket. Med dette settet følges en rekke trinn for å bygge et sekvenseringsbibliotek fra kliniske prøver. Biblioteket sekvenseres deretter på en ionehalvledersekvenseringsplattform, med ANNOVAR brukt til å kommentere resultatene. Etter sekvensering brukes et dokument til å oppsummere mutanttypene for hver prøve. Fraværet av en mutanttype indikerte at prøven ikke gjennomgikk den spesifikke mutasjonen. Tilleggstabell3 gir et typisk eksempel på dette. Tabell 12 inneholder grunnleggende informasjon om SNP-ene som er oppdaget her. Analysere hver SNP-er ved hjelp av filterbasert merknad i ulike databaser, for eksempel 1000 Genomes Project (1000g2015aug; https://www.internationalgenome.org/; Tabell 13) og Exome Aggregation Consortium (ExAC; https://gnomad.broadinstitute.org/; Tabell 14), kan avsløre at forskjellige SNP-er er signifikant tilstede i forskjellige populasjoner. Figur 1: Flytskjema for protokollen. Flytskjema for multigendeteksjon for magekreft ved bruk av halvledersekvenseringsmetode. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren. Kromosom Plassering Intervall for primerdesign Venstre primer Riktig primer chr1 11854475 chr1:11854175-11854775 ACAGGATGGGGAAGTCACAG AAACCGGAATGGTCACAAAG 11856377 chr1:11856077-11856677 CTTCAGGTCAGCCTCAAAGC TCCCTGTGGTCTCTTCATCC chr5 79950780 CHR5:79950480-79951080 CGCCGCACATAGTAGGTTCT CTTCCTCCTCCAGCCCTATC 79951495 CHR5:79951195-79951795 CTTGGGTCACCTGCACAGTA ATTTTGAAGCACCCAAGCTG chr1 237048499 chr1:237048199-237048799 GTCAAAGGCCAGTCCCTTCT CTCCCTTCACCAACTGTGCT chr8 63938763 CHR8:63938463-63939063 CAGTGAAGTTCAGCGGCAT TATTTTTTCCTGTGTGGGGCAC CHR21 46934825 CHR21:46934525-46935125 CCAACCTGAGATGGCTTTTC TCCTTGGTGCTCTTGCTTTT Tabell 1: Primere brukt for de syv utvalgte SNP-ene i fem gener. Dette arket viser informasjon om plasseringen av primerne til SNP-er assosiert med 5-FU-resistens ved magekreft. Temperatur Tid Nei. av sykluser 99 °C 2 min 1 syklus 99 °C 15 sekunder 22 sykluser 60 °C 4 min 10 °C Holde 1 syklus Tabell 2: Termisk syklusprogram for DNA-amplifikasjon. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. Skritt Temperatur Tid Nei. av sykluser Aktivere enzymer 99 °C 2 min 1 syklus Denaturere 99 °C 15 sekunder 30 sykluser Anneal og forlengelse 60 °C 4 min Bevare 10 °C Holde 1 syklus Tabell 3: Termisk syklusprogram for cDNA-amplifikasjon. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. Temperatur Tid Nei. av sykluser 50 °C 10 minutter 1 syklus 55 °C 10 minutter 1 syklus 60 °C 20 min 1 syklus 10 °C Holde 1 syklus Tabell 4: Termisk syklusprogram for fordøyelse av primersekvens. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. Komponent Volum P1-adapter 1,5 μL Spesifikk adapter X 1,5 μL Nukleasefritt vann 3 μL Totalt volum av reaksjonssystem 6 μL X: Angir det spesifikke adapternummeret Tabell 5: Sekvens for tilsetning av reagenser for fremstilling av adapterblanding. Tilsett reagenser i røret i den rekkefølgen som er angitt her. Komponent Volum Koble til buffer 4 μL Adapter blanding X 2 μL DNA-ligase 2 μL Totalt volum av reaksjonssystem 30 μL Tabell 6: Sekvens for tilsetning av reagenser til den fordøyde primerproduksjonen. Tilsett reagenser i røret i den rekkefølgen som er angitt her. Temperatur Tid Nei. av sykluser 22 °C 30 min 1 syklus 72 °C 10 minutter 1 syklus 10 °C Holde 1 syklus Tabell 7: Termisk syklusprogram for tilkobling av adapter til DNA. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. Temperatur Tid Nei. av sykluser 22 °C 30 min 1 syklus 68 °C 5 min 1 syklus 72 °C 5 min 1 syklus 10 °C Holde 1 syklus Tabell 8: Termisk syklusprogram for tilkobling av adapter til cDNA. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. Komponent Volum Reaksjonsløsning av bibliotekforsterkning 50 μL Bibliotek primer blanding 2 μL Totalt volum av reaksjonssystem 52 μL Tabell 9: Sekvens for tilsetning av amplifikasjonsreagenser. Tilsett reagenser i røret i den rekkefølgen som er angitt her. Temperatur Tid Nei. av sykluser 98 °C 2 min 1 syklus 98 °C 15 sekunder 5 sykluser 60 °C 1 min 10 °C Holde 1 syklus Tabell 10: Termisk syklusprogram for amplifisering av DNA-bibliotek. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. Temperatur Tid Nei. av sykluser 98 °C 2 min 1 syklus 98 °C 15 sekunder 5 sykluser 64 °C 1 min 10 °C Holde 1 syklus Tabell 11: Termisk syklusprogram for amplifisering av cDNA-bibliotek. Termiske reaksjonsforhold som temperatur, tid og sykluser vises. rs1801131 Rs1801133 Rs1650697 rs442767 Rs1805087 Rs11545078 Rs1051298 Ref T G En G En G G Alt G En G T G En En Func.refGeneWithVer eksonisk eksonisk UTR5 oppstrøms eksonisk eksonisk UTR3 Gen.refGeneWithVer MTHFR MTHFR DHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 Gen-detaljer.refGeneWithVer . . NG_023304.1:g.5020T>G . . . NM_001205206.1:c.*64C>T;NM_001205207.1:c.*746C>T;NM_194255.2:c.*746C>T Eksonisk Func.refGeneWithVer ikke-synonym;SNV ikke-synonym;SNV . . ikke-synonym;SNV ikke-synonym;SNV . AAChange.refGeneWithVer MTHFR:NM_001330358.1:ekson8:c.A1409C:p.E470A; MTHFR:NM_005957.4:exon8:c.A1286C:p.E429A MTHFR:NM_001330358.1:ekson5:c.C788T:p.A263V; MTHFR:NM_005957.4:exon5:c.C665T:p.A222V . . MTR:NM_001291939.1:exon25:c.A2603G:p.D868G; MTR:NM_001291940.1:exon25:c.A1535G:p.D512G;MTR:NM_000254.2:Exon26:c.A2756G:p.D919G GGH:NM_003878.2:exon5:c.C452T:p.T151I Jin cytoBand 1p36.22 1p36.22 5q14.1 5q14.1 1q43 8q12.3 21q22.3 Tabell 12: Relevant informasjon om SNP-ene. Kommentere prøvene ved hjelp av ANNOVAR. MTHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 rs1801131 Rs1801133 Rs1650697 rs442767 Rs1805087 Rs11545078 Rs1051298 1000g2015aug_all 0.249401 0.245407 0.76857 0.290136 0.218251 0.085463 0.524361 1000g2015aug_afr 0.1513 0.09 0.9349 0.0318 0.2844 0.056 0.5772 1000g2015aug_amr 0.1513 0.4741 0.755 0.3991 0.1772 0.0403 0.4323 1000g2015aug_eas 0.2192 0.2956 0.6607 0.5853 0.1052 0.0873 0.5635 1000g2015aug_eur 0.3131 0.3648 0.7555 0.3191 0.173 0.0924 0.4493 1000g2015aug_sas 0.4172 0.1186 0.6779 0.228 0.3211 0.1483 0.5552 Tabell 13: Filterbasert annotering av SNP-er i 1000 Genomes Project. MTHFR DHFR MTR GGH SLC19A1 rs1801131 Rs1801133 Rs1650697 rs442767 Rs1805087 Rs11545078 Rs1051298 ExAC_ALL 0.295 0.3037 . . 0.2091 0.0936 . ExAC_AFR 0.1588 0.1124 . . 0.2666 0.0545 . ExAC_AMR 0.1555 0.5141 . . 0.1864 0.0361 . ExAC_EAS 0.2148 0.3052 . . 0.1132 0.0824 . ExAC_FIN 0.3128 0.2227 . . 0.1892 0.0581 . ExAC_NFE 0.3191 0.345 . . 0.1919 0.0969 . ExAC_OTH 0.304 0.3062 . . 0.2108 0.0973 . ExAC_SAS 0.4153 0.1409 . . 0.316 0.165 . Tabell 14: Filterbasert annotering av SNP-er i Exome Aggregation Consortium. Tilleggstabell 1: Sekvens for tilsetning av reagenser for DNA-amplifikasjon. Tilsett reagenser i røret i den rekkefølgen som er angitt her. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggstabell 2: Sekvens for tilsetning av reagenser for cDNA-amplifikasjon. Tilsett reagenser i røret i den rekkefølgen som er angitt her. Klikk her for å laste ned denne filen. Tilleggstabell 3: Eksempel på kliniske prøvesekvenseringsresultater. Bare mutasjoner som er tilstede i prøvene vil bli registrert i dokumentene. Klikk her for å laste ned denne filen.

Discussion

Kliniske eksperter er enstemmig enige om at pasienter, selv med samme type og stadium av magekreft, kan ha markant forskjellige responser på en identisk behandlingstilnærming. År med forskning har avslørt for forskere at de individuelle variasjonene hovedsakelig tilskrives magekreftens natur som en heterogen, polymorf og mangfoldig differensiert cellulær populasjon, noe som fører til betydelige individuelle forskjeller i behandlingsresponser²⁸. Følgelig muliggjør innsamling av magekreftprøver gjennom øvre gastrointestinal endoskopi eller kirurgi og blodprøver, kombinert med sekvensering med høy gjennomstrømning for genetisk analyse, personlig behandling av magekreft. Denne strategien er utformet for å forbedre klinisk behandlingseffekt og redusere risikoen for alvorlige toksiske bivirkninger. Fremskrittene innen ionehalvledersekvenseringsteknologi har gjort personlig behandling til en praktisk realitet²⁹.

Her er noen begrensninger ved denne testmetoden. Settet som brukes her er først og fremst for in vitro-diagnose , så det er begrenset til å oppdage mutasjonen av rs1801131 og rs1801133 av MTHFR-genet , rs1650697 og rs442767 av DHFR-genet , rs1805087 av MTR-genet , rs11545078 av GGH-genet og rs1051298 av SLC19A1. Mutasjon i andre seksjoner kan ikke påvises. På grunn av betydelig heterogenitet i tumorvev kan ulike prøvetakingssteder påvirke deteksjonsresultatene. For parafininnstøpte vevsprøver som lagres over lengre tid, kan DNA og RNA brytes ned til en viss grad, noe som påvirker testresultatene. Urimelig prøveinnsamling, transport og prosessering, samt feil eksperimentell drift og eksperimentelt miljø kan føre til falske negative eller falske positive resultater. Deteksjonsresultatet kan ikke garanteres hvis nukleinsyrekonsentrasjonen er lavere enn 2 ng/μL. Testresultatene av settet er kun for klinisk referanse. Valg av persontilpasset behandling for pasienter bør vurderes i kombinasjon med deres symptomer/tegn, sykehistorie, andre laboratorietester og behandlingsreaksjoner. Negative resultater kan ikke helt utelukke eksistensen av målgenmutasjon. Negative resultater kan også være forårsaket av for få tumorceller i prøven, overdreven nedbrytning av nukleinsyre eller konsentrasjonen av målgenet i amplifikasjonsreaksjonssystemet under deteksjonsgrensen.

Noen ytelsesindekser for settet som brukes er som beskrevet. Analytisk sensitivitet: For DNA-prøver er den minste påvisbare mengden av den totale nukleinsyren i dette settet 10 ng, og 5 % mutasjonshastighet kan påvises. For RNA-prøver er den minste påvisbare mengden av den totale nukleinsyren i dette settet 10 ng. Positiv og negativ sammenfallsrate: Den positive og negative sammenfallsraten når 100 %. Deteksjonsgrense (LOD): Totalt 14 LOD-referanser, nummerert L1-L14 kan brukes. L1-L11 er LOD-referanser for MTHFR-, DHFR-, MTR-, GGH – og SLC19A1-gener , og deres deteksjonsresultater bør være at mutasjonstypene til de tilsvarende genstedene er positive, og sammenfallsratene er 100 %. Repeterbarhet: Totalt fem repeterende referansematerialer, nummerert R1-R5 kan brukes. R1 er et sterkt positivt repeterende referansemateriale (rs67376798 mutasjon av DPYD-genet ). R2, som inneholder denne mutasjonen i mindre antall, er et svakt positivt repeterende referansemateriale (rs67376798 mutasjon av DPYD-genet ), R3 er et negativt repeterende referansemateriale (6 steder av DPYD-, MTHFR- og ABCB1-genene er påvist som villtype). Hver referanseprøve må testes 10 ganger, for å sikre at resultatene av disse gjentatte vurderingene samsvarer med deres forhåndsdefinerte klassifiseringer. Datavolum: Det effektive datavolumet til DNA- og RNA-prøver bør kontrolleres over 0,05 M. Sekvenseringsdybden til DNA-prøver skal kontrolleres over 500, og Mapped Reads av RNA-prøver skal kontrolleres over 20000. Interferenstest: Dette settet påvirkes ikke av endogene interferensstoffer (triglyserider og albumin) og eksogene interferensstoffer (formalin og dehydrert alkohol).

Noen forholdsregler må overholdes under eksperimentet. Settet som brukes her kan kun brukes til in vitro-testing. Vennligst les denne håndboken nøye før eksperimentet og bruk den innen gyldighetsperioden. Komponenter i settet i forskjellige partier kan ikke brukes om hverandre. Det anbefales å bruke engangsforbruksvarer til dette settet for å forhindre forurensning. Under bruk av dette settet anbefales det å bruke et sugehode med et filterelement. For å unngå potensielle biologiske farer i prøven, bør testprøven betraktes som smittestoffer for å unngå kontakt med hud og slimhinner. Det anbefales å håndtere prøvene i et biosikkerhetsskap som kan forhindre utstrømning av aerosoler. Reagensrør og suger som brukes i operasjonen bør steriliseres før de kastes. Drift og avhending av prøver skal oppfylle kravene i relevante lover og forskrifter: Generelle retningslinjer for biosikkerhet for mikrobielle biomedisinske laboratorier og forskrifter om håndtering av medisinsk avfall fra Helsedepartementet^30,31. Det eksperimentelle personellet må få profesjonell opplæring, operere i strengt samsvar med instruksjonene og strengt skille områdene i henhold til den eksperimentelle prosessen. Spesielle instrumenter og utstyr skal brukes på hvert trinn av forsøksoperasjonen, og artiklene på hvert trinn i hvert område skal ikke brukes om hverandre. Det eksperimentelle personellet må strengt skille områdene i henhold til den eksperimentelle prosessen. Spesielle instrumenter og utstyr skal brukes på hvert trinn av den eksperimentelle operasjonen. Ta beskyttelsestiltak etter behov, for eksempel hansker, arbeidsklær osv. Avfallshåndtering skal være i samsvar med relevante nasjonale forskrifter.

Selv om fokuset i denne artikkelen er på de syv SNP-ene innenfor fem gener relatert til magekreft, er sekvenseringen i praktiske anvendelser ikke begrenset til disse fem genene alene. Denne artikkelen etablerer definitivt en signifikant korrelasjon mellom de syv SNP-ene og følsomheten for 5-FU kjemoterapi ved magekreft.

Materials

1.5 mL DNA LoBind Tubes	Eppendorf	30108051
50 mL tubes	Greiner Bio-One	227261
Amplification primer of gastric cancer	Thermo Fisher		The primers are sythesized by Thermo Fshier according to the sequence in Table 1.
Deparaffinization	Qiagen	19093
DNA purification magnetic beads	Bechkman	A63881
Ethyl alcohol	Guangzhou Chemical Reagent Factory Thermo Fisher Scientific		http://www.chemicalreagent.com/
Ion AmpliSeq Library Kit 2.0	Thermo Fisher	4480441
Nuclease-Free Water	Life Technologies	AM9932
PCR tubes	Axygen	PCR-02D-C
PCR tubes	Axygen	PCR-02D-C
Pipette tips	Quality Scientific Products		https://www.qsptips.com/products/standard_pipette_tips.aspx
PureLink RNA Mini Columns	Thermo Fisher	A29839
RecoverAll Total Nucleic Acid Isolation Kit	Thermo Fisher	AM1975
Tabletop mini centrifuge	SCILOGES	S1010E
Thermal Cycler	Life Technologies	4375786
Ultramicro nucleic acid analyzer	BEIJING ORIENTAL SCIENCE & TECHNOLOGY DEVELOPMENT LTD.	BD-1000