פרוטוקול זה נועד להעריך פפטידים ביו-פונקציונליים להרכבה עצמית עבור הידבקות תאים, מורפולוגיה אורגנואידית וביטוי גנים על ידי אימונוסטיין. אנו נשתמש בקו תאי סרטן המעי הגס כדי לספק דרך חסכונית להשגת אורגנואידים לבדיקות אינטנסיביות.
פפטידים אולטרה-קצרים להרכבה עצמית (SAPs) יכולים ליצור באופן ספונטני ננו-סיבים הדומים למטריצה חוץ-תאית. סיבים אלה מאפשרים היווצרות של הידרוג’לים תואמים ביולוגית, מתכלים ולא אימונוגניים. הוכחנו בעבר כי SAPs, כאשר הם מתפקדים ביולוגית עם מוטיבים שמקורם בחלבון, יכולים לחקות את מאפייני המטריצה החוץ תאיים התומכים בהיווצרות אורגנואידים במעי הגס. הידרוג’לים פפטידים ביו-פונקציונליים אלה שומרים על התכונות המכניות, יכולת הכוונון ויכולת ההדפסה של פפטיד האב המקורי תוך שילוב רמזים המאפשרים אינטראקציות בין מטריצת התא להגביר את הידבקות התא. מאמר זה מציג את הפרוטוקולים הדרושים כדי להעריך ולאפיין את ההשפעות של הידרוג’לים פפטידים ביו-פונקציונליים שונים על הידבקות תאים והיווצרות לומן באמצעות קו תאים סרטני אדנוקרצינומה המסוגל ליצור אורגנואידים של סרטן המעי הגס בצורה חסכונית. פרוטוקולים אלה יסייעו להעריך את ההשפעות של פפטיד הידרוג’ל ביו-פונקציונלי על הידבקות תאים והיווצרות לומינלית באמצעות צביעה חיסונית וניתוח תמונה פלואורסצנטית. קו התאים ששימש במחקר זה שימש בעבר לייצור אורגנואידים במטריצות שמקורן בבעלי חיים.
בשנים האחרונות, פפטידים להרכבה עצמית (SAPs) התגלו כביו-חומרים מבטיחים ליישומי הנדסת רקמות. ל-SAPs תכונות ייחודיות, כולל היווצרות ספונטנית של ננו-סיבים, תאימות ביולוגית, מתכלות ביולוגית ואי-אימונוגניות, מה שהופך אותם למועמדים אטרקטיביים לפיתוח פיגומים1. SAPs שימשו בעבר יחד עם סוגים שונים של תאים, ובעיקר, SAPs אולטרה קצרים דווחו הקלו על אנקפסולציה של תאי גזע תוך שמירה על פלוריפוטנטיות שלהם לאורך תקופות ממושכות הכוללות יותר מ -30 מעברים עם שכיחות מינימלית של סטיות כרומוזומליות 2,3,4. לפיכך, התאמת SAPs לשימוש בהם בתרבות אורגנואידים היוותה צעד רציונלי עוקב.
אורגנואידים הם מבנים תלת-ממדיים מורכבים הנובעים מתאים פלוריפוטנטיים בודדים. מבנים אלה יוצרים סוגי תאים שונים, אשר לאחר מכן מתארגנים בעצמם כדי לשכפל את תהליכי ההתפתחות של גדילת עוברים ורקמות במבחנה5. מסגרת חדשנית זו התפתחה לכלי אדיר לחקירות חוץ גופיות, תוך שימור יעיל של התכונות הגנטיות, הפנוטיפיות וההתנהגותיות המאפיינות איברים in vivo 6. עם זאת, מכשול עיקרי במעבר מהספסל למיטה של ממצאים מבוססי אורגנואידים הוא הצורך בשחזור7. שונות זו בתוצאות מיוחסת בעיקר לקושי בהתמיינות מלאה של תאי גזע פלוריפוטנטיים אנושיים לשושלות תאים מתמחים, בנוסף להיעדר ארכיטקטורת רקמות אותנטית ולמורכבות האינהרנטית בה נתקלים במודלים אורגנואידים. לאור העלייה בפופולריות של מחקרים מבוססי תאי גזע ואורגנואידים8, חלה עלייה בביקוש לביו-חומרים בעלי תכונות מכניות דינמיות ואתרי הדבקה דמויי אינטגרין או פיגומים עם יכולת פירוק מבוקרת 7,9. ניתן לכוונן תכונות אלה ביעילות באמצעות ניצול אסטרטגי של SAPs ביו-פונקציונליים.
SAPs הם רצפים קצרים של חומצות אמינו עם היכולת הטבועה להתארגן באופן ספונטני למבנים מוגדרים היטב10. פפטידים אלה מכילים לעתים קרובות שאריות הידרופוביות והידרופיליות לסירוגין, אשר מניעות את הרכבתם העצמית באמצעות אינטראקציות לא קוולנטיות, כולל קשרי מימן, אינטראקציות אלקטרוסטטיות והשפעות הידרופוביות11,12. תהליך ההרכבה העצמית של פפטידים אלה מונע בעיקר על ידי הצורך למזער את האנרגיה החופשית של המערכת. כאשר הם נמצאים בסביבה מימית, השאריות ההידרופוביות נוטות להתקבץ יחד כדי למזער את חשיפתן למים, בעוד שהשאריות ההידרופיליות מתקשרות עם מולקולות המים שמסביב. תופעה זו מובילה להיווצרות ננו-מבנים שונים. במקרה זה, פפטידים אולטרה-קצרים להרכבה עצמית יוצרים ננו-סיבים בעלי מאפיינים התלויים ברצף הפפטיד ובתנאי הסביבה 2,12,13,14,15,16. הפפטידים האלה מאמצים קונפורמציה של β סיבובים, שבה גדילי פפטידים בודדים מתיישרים במקביל או נגד מקבילים זה לזה, ומיוצבים על-ידי קשרי מימן (איור 1). נוכחותם של יונים חיוביים מאיצה את תהליכי ההרכבה העצמית המובילים להיווצרות ננו-סיבים.
ננו-סיבים פפטידים זוהו כבעלי יכולת מולדת ללכוד כמויות משמעותיות של מים. מאפיין זה מאפשר יצירת הידרוג’ל, אשר לאחר מכן מתבטא כחלל תלת מימדי תואם ביולוגית ומתכלה התורם לשגשוג וצמיחה תאית. ננו-סיבים פפטידים אלה בהרכבה עצמית מחקים באופן מורכב את התכונות הטופוגרפיות הטבועות בסביבת המטריצה החוץ-תאית הטבעית (ECM)1. דמיון זה מעניק לתאים סביבה המחקה את סביבת המחיה הפיזיולוגית שלהם, ומקדם עוד יותר פעילות תאית מיטבית17. יתר על כן, הרבגוניות הטבועה בפפטידים אלה מאפשרת מידה ניכרת של כוונון4. יכולת הסתגלות כזו מאפשרת שינויים בתכונות המטריצה, כגון קשיחות, קינטיקה ג’לציונית ונקבוביות. התאמות אלה מושגות באמצעות שינויים ברצף הפפטידים. כתוצאה מכך, פפטידים להרכבה עצמית (SAPs) התגלו כמרכיבים מרכזיים במדע הביו-חומרים העכשווי, בשימוש נרחב כפיגומים להתחדשות רקמות ולתרבית תאית13,17.
אחד היתרונות הקריטיים של פפטידים בהרכבה עצמית הוא יכולתם להיות מסונתזים ומשתנים בקלות ברמה המולקולרית. יתרון זה מאפשר שילוב של קבוצות פונקציונליות ספציפיות או מוטיבים ביו-אקטיביים ברצף הפפטידים, מה שמאפשר תכנון של פפטידים בעלי תכונות ופונקציות מותאמותאישית 18,19,20 (איור 1B). לדוגמה, ניתן לתכנן SAPs ביו-פונקציונליים כך שיחקו את ה-ECM ויקדמו התמיינות באמצעות פפטיד RGD19,21. פפטיד בן-IKVAV דווח גם כמגביר באופן משמעותי את הביטוי של סמנים ספציפיים לנוירונים בשל המוטיטי הספציפי לליגנד22. ניתן גם להנדס פפטידים אלה כך שיציגו מולקולות ביו-אקטיביות, כגון פפטידים קושרי אינטגרין, כדי לשפר את הישרדות התא23. לבסוף, SAPs ביו-פונקציונליים אחרים פותחו כדי לקדם אנגיוגנזה על ידי הכללת המוטיבים IKVAV ו- YIGSR במבנים שלהם24.
SAPs ביו-פונקציונליים שדווחו בפרסום מוקדם יותר מראים כי ניתן לשנות עוד יותר הרכבה עצמית על ידי הכללת הפפטיד הנאיבי שממנו נגזר SAPהביו-פונקציונלי 25. תערובות SAP אלה יכולות גם לספק מגוון רחב של פורמולציות SAP הנבדלות זו מזו בפעילות הביוכימית ובתכונות הפיזיקוכימיות שלהן. לדוגמה, הפפטיד האמפיפילי IIFK הוא SAP אולטרה-קצר שיכול לעמוד בביו-פונקציונליזציה עם מוטיבים שונים, כפי שמודגם על-ידי שילוב מוטיב IKVAV (איור 1B). שני הפפטידים יכולים ליצור ננו-סיבים, גם לבד וגם ביחד. כל נוסחה יוצרת הידרוג’לים בעלי תכונות פיזיקליות שונות (איור 2)
עם זאת, בגלל המגוון הרחב של תמורות פוטנציאליות וחלופות המתקבלות מהביו-פונקציונליזציה של SAPs, יש צורך לספק אפשרות מהירה וחסכונית לבדיקת אורגנואידים. מועמד אחד להערכה אורגנואידית אינטנסיבית וחסכונית כזו הוא קו התאים SW1222, הנגזר מאדנוקרצינומה של המעי הגס האנושי26,27. לתאי SW1222 יש מאפיינים המאפשרים את צבירתם למבנים תלת-ממדיים הדומים לאורגנואידים, מה שהופך אותם למודל אידיאלי לחקר התפתחות רקמות ויישומי רפואה רגנרטיבית. תאי SW1222 זוהו כמסוגלים לייצר אורגנואידים בשל ביטוי היתר הפנימי שלהם של הגן LGR5 27. יצירת אורגנואידים מתאי גזע בודדים LGR5+ הוצגה באופן משכנע בעבר, כמו גם הנטייה של תאי SW1222 להשיג מאפיינים מורפולוגיים של אורגנואיד סרטן המעי הגס28.
במאמר שיטות זה אנו מציגים פרוטוקולים מפורטים להערכה ולאפיון ההשפעות של פפטידים ביו-פונקציונליים שונים על הידבקות תאים והיווצרות לומן באמצעות תאי SW1222 (איור 3). על ידי מתן נהלים שלב אחר שלב ושיטות ניתוח הדמיה, אנו מקווים להציע תובנות יקרות ערך לגבי ייצור ביולוגי של אורגנואידים והערכה של מטריצות SAP פשטניות עבור תרבית אורגנואידים.
הפוטנציאל העצום של SAPs במחקר ביו-רפואי מודגש על ידי הגמישות ויכולת ההסתגלות שלהם באמצעות ביו-פונקציונליזציה. עם מערך כה נרחב של תמורות, האתגר מתעורר בבדיקה יעילה ובקביעת התצורות המבטיחות ביותר עבור יישומים ספציפיים, במיוחד במחקר אורגנואידים. פתרון מהיר וחסכוני הוא בעל חשיבות עליונה. קו הת…
The authors have nothing to disclose.
עבודה זו נתמכה כספית על ידי אוניברסיטת המלך עבדאללה למדע וטכנולוגיה. המחברים מודים למענק קרן הסיד של KAUST ולקרן החדשנות של KAUST שהוענקו על ידי החדשנות והפיתוח הכלכלי של KAUST. המחברים מבקשים להודות למעבדות הליבה של KAUST למדעי הביולוגיה וההדמיה על תמיכתן באפיון ביולוגי ובניתוח מיקרוסקופיה.
1x PBS | Gibco | 14190144 | |
6-well plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-83 | |
10x PBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 70011044 | |
16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free | Thermo Scientific | 28906 | |
24-well plate, tissue culture treated | Corning | 09-761-146 | |
96-well black plate, tissue culture treated | Corning | 07-200-565 | |
alamarBlue Cell Viability Reagent | Invitrogen | DAL1025 | |
Anti-Ezrin antibody, rabbit monoclonal | Abcam | ab40839 | Secondary used: anti-rabbit Dylight 633 |
Anti-pan Cadherin antibody, rabbit polyclonal | Abcam | ab16505 | Secondary used: anti-rabbit Alexa 488 |
Anti-ZO1 tight junction antibody, goat polyclonal | Abcam | ab190085 | Secondary used: anti-goat Alexa 488 |
BSA | Sigma-Aldrich | A9418 | |
Cellpose 2.0 | NA | NA | Obtained from https://github.com/MouseLand/cellpose |
Confocal Laser Scanning Microscope with Airyscan | ZEISS | LSM 880 | |
DAPI | Invitrogen | D1306 | |
Donkey anti-Goat IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11055 | |
Glycine | Cytiva | GE17-1323-01 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11008 | |
Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, DyLight 633 | Invitrogen | 35562 | |
Heat Inactivated Fetal Bovine Serum (HI FBS) | Gibco | 16140071 | |
ImageJ 1.54f | NIH | NA | |
IMDM | Gibco | 12440079 | |
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells | Invitrogen | L3224 | |
Magnesium Chloride, hexahydrate (MgCl2 6 H2O) | Sigma-Aldrich | M2393 | |
Matrigel for Organoid Culture, phenol-red free | Corning | 356255 | Refered in the manuscript as Matrigel or basement membrane matrix. |
Microscope, brightfield | |||
Microscope, EVOS | Thermo Scientific | EVOS M7000 | |
OriginPro 2023 (64-bit) 10.0.0.154 | OriginLab Corp | NA | |
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
Peptide P (Ac,Ile,Ile,Phe,Lys,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P1 (Ac, Ile, Ile, Phe, Lys, Gly, Gly, Gly, Arg, Gly, Asp, Ser, NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Peptide P2 (Ac, Ile,Ile,Phe,Lys,Gly,Gly,Gly,Ile,Lys,Val,Ala,Val,NH2) | Lab-made | NA | Can be custom-made by peptide manufacturers such as Bachem. |
Rhodamine Phalloidin | Invitrogen | R415 | |
Round Cover Slip, 10 mm diameter | VWR | 631-0170 | |
Scanning Electron Microscope | Thermo Fisher – FEI | TENEO VS | |
Sterile 30 μm strainer | Sysmex | 04-004-2326 | |
sucrose | Sigma-Aldrich | S1888 | |
SW1222 cell line | ECACC | 12022910 | |
Triton x-100 | Thermo Scientific | 85111 | |
Trypsin-EDTA 0.25% | Gibco | 25200056 | |
Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | |
UltraPure water | Invitrogen | 10977015 |