Een veelzijdig glazen pottensysteem voor semihydroponische wortelexsudaatprofilering

Summary

We presenteren een protocol voor een op glas gebaseerd, semi-hydroponisch experimenteel systeem dat de groei ondersteunt van een verscheidenheid aan fylogenetisch verschillende planten met of zonder microben. Het systeem is compatibel met verschillende groeimedia en maakt niet-destructieve bemonstering van wortelexsudaat mogelijk voor stroomafwaartse analyse.

Abstract

Wortelexsudaten vormen het grensvlak tussen plant en bodem, zijn betrokken bij de kringloop van voedingsstoffen en moduleren interacties met bodemorganismen. Wortelexudaten zijn dynamisch en worden gevormd door biologische, omgevings- en experimentele omstandigheden. Vanwege hun grote diversiteit en lage concentraties zijn nauwkeurige exsudaatprofielen een uitdaging om te bepalen, vooral in natuurlijke omgevingen waar andere organismen aanwezig zijn, waarbij plantaardige verbindingen worden omgezet en zelf extra verbindingen worden geproduceerd. Het semi-hydroponische experimentele systeem voor glazen potten dat hier is geïntroduceerd, maakt controle mogelijk over biologische, omgevings- en experimentele factoren. Het maakt de groei mogelijk van verschillende fylogenetisch verschillende plantensoorten gedurende maximaal enkele maanden, met of zonder microben, in een verscheidenheid aan verschillende groeimedia. Het op glas gebaseerde ontwerp biedt een achtergrond met een lage metaboliet voor een hoge gevoeligheid en een lage impact op het milieu, omdat het kan worden hergebruikt. Exsudaten kunnen niet-destructief worden bemonsterd en de omstandigheden kunnen desgewenst in de loop van een experiment worden gewijzigd. De opstelling is compatibel met massaspectrometrie-analyse en andere stroomafwaartse analytische procedures. Samengevat presenteren we een veelzijdig groeisysteem dat geschikt is voor gevoelige wortelexsudaatanalyse in verschillende omstandigheden.

Introduction

Binnen dichtbevolkte bodems vormt de rhizosfeer een koolstofrijke niche. Het wordt gevormd door plantenwortels via de exsudatie van maximaal 20% van de geassimileerde koolstof en herbergt microbiële gemeenschappen die verschillen van het inwonende bodemmicrobioom 1,2,3,4,5,6. Terwijl onderzoekers gebruik maken van de gunstige functies van wortel-geassocieerde microben en het potentieel voor duurzame landbouw dat daarmee gepaard gaat⁷, is deze observatie, vaak aangeduid als het rhizosfeereffect, de focus geweest van groeiende wetenschappelijke inspanningen. Tot nu toe blijft de chemische dialoog tussen micro-organismen en planten, waarvan wordt voorgesteld dat deze de aanjager is van het rhizosfeereffect, echter slecht begrepen en daarom is het mechanistische begrip voor de ontwikkeling van betrouwbare microbiële oplossingen in de landbouw beperkt ^8,9,10.

Het ontcijferen van wortelexsudaten in bodemomgevingen waar metabolieten gemakkelijk worden opgenomen door bodemdeeltjes en snel worden omgezet door microbiële gemeenschappen is niet eenvoudig, vooral niet voor plantensoorten met fijne wortelstelsels zoals de modelplant Arabidopsis thaliana¹¹. Dit is de reden waarom in de meeste onderzoeken wortelexsudaten worden bemonsterd uit hydrocultuursystemen. In deze microkosmos worden bovengrondse delen van planten op hun plaats gehouden door op maat gemaakte plantenhouders of meer ingehouden materialen zoals gaas, agar en glaskralen. De gebruikte containers variëren van petrischalen over multi-well platen tot verschillende op maat gemaakte en commerciële dozen met of zonder beluchtingsfilters 12,13,14,15,16,17,18,19. Afhankelijk van het systeem zullen de groeiomstandigheden van de plant sterk variëren en in meer of mindere mate de natuurlijke omstandigheden weerspiegelen.

Hier presenteren we een op glas gebaseerd, semi-hydrocultuursysteem dat experimenteel vatbaar is en zeer reproduceerbare resultaten oplevert. Het is eenvoudig te monteren en te gebruiken en is gebaseerd op algemeen verkrijgbare materialen. Het systeem is gebaseerd op een glazen pot gevuld met glaskralen, waarbij gebruik wordt gemaakt van het herbruikbare karakter en de lage bindingseigenschappen van glaswerk (Figuur 1). De kralen bieden fysieke ondersteuning voor de groeiende plant en simuleren mechanische impedantie, wat bijdraagt aan een meer aarde-achtige wortelarchitectuur in vergelijking met hydrocultuuropstellingen 19,20,21. Als ze worden ingeënt met microben, vormen de glasparels oppervlakken waar bacteriën zich aan kunnen hechten.

De glazen pot kan worden gesloten om de steriliteit te behouden en het systeem is ontworpen om voldoende hoofdruimte en luchtcirculatie mogelijk te maken, waardoor een omgeving die verzadigd is met vochtigheid wordt vermeden. De potten zijn geschikt voor de langdurige groei van verschillende plantensoorten en kunnen worden op- en afgeschaald met potten van verschillende grootte. Hier worden toepassingen getoond voor zes plantensoorten, waaronder C3- en C4-grassen, tweezaadlobbige planten en peulvruchten. Onder hen zijn de modelsoorten A. thaliana (tweezaadlobbige), Brachypodium distachyon (C3 eenzaadlobbig), Medicago truncatula (peulvrucht), evenals gewassoorten zoals Solanum lycopersicum (tomaat, tweezaadlobbige), Triticum aestivum (tarwe, C3 eenzaadlobbig) en Sorghum bicolor (sorghum, C4 eenzaadlobbig). Het gepresenteerde protocol omvat de experimentele opzet van het systeem, zaadsterilisatie en ontkieming van zes plantensoorten, transplantatie van zaailingen naar potten, verschillende groeimedia, inenting van microben, bemonstering van wortelexsudaat en exsudaatverwerking voor analyse.

Protocol

1. Voorbereiding van zaailingen: oppervlaktesterilisatie van zaden NOTITIE: De oppervlaktesterilisatie van zaden en alle volgende stappen moeten in steriele omstandigheden worden uitgevoerd, tenzij anders vermeld. Stappen 1.1 tot en met 1.4 zijn specifiek voor oppervlaktesterilisatie van A. thaliana zaden. Andere plantensoorten hebben alternatieve variaties in buisgrootte (afhankelijk van het aantal zaden en zaadgrootte), tijd in oplossingen en sterilisatieoplossingen (tabel 1). Voeg zaden toe aan een microcentrifugebuis (maximaal 20 mg zaden) en bedek de zaden met 70% ethanol.LET OP: Ethanol is ontvlambaar. Niet gebruiken in de buurt van open vuur. Verplaats de gesloten microcentrifugebuisjes gedurende 15 minuten naar een shaker en stel de rotatie zo in dat de zaden voorzichtig worden geschud. Verwijder voorzichtig 70% ethanol met een pipet en vervang deze door 100% ethanol. Herhaal stap 1.2. Verwijder 100% ethanol en droog de zaden door de deksels van de microcentrifugebuis open te laten staan in een steriele luchtstroom. Zodra de zaden droog zijn, verdeel je ze gelijkmatig over 0,5x Murashige en Skoog (MS) medium met 0,7% fyto-agar door op de buis te tikken of een steriele pincet te gebruiken. Sluit de agarplaten en sluit ze af met microporiëntape van 1,25 cm. Plaats de platen horizontaal op een plank in de groeikamer (16 uur licht/8 uur donker, 22 °C dag/18 °C nacht, 150-160 μmol m-2 s-1). 2. Voorbereiding van zaailingen: Overbrengen van ontkiemde zaden naar verse borden OPMERKING: De volgende stappen zijn specifiek voor A. thaliana en zijn niet nodig voor andere soorten. Breng na het ontkiemen 5 tot 6 zaailingen over op nieuwe 0,7% fyto-agarplaten met 0,5x MS-medium door de zaailingen lineair te plaatsen, ongeveer 3 cm van de bovenkant (zie de positie van de rozet in figuur 2D). Sluit de agarplaten af met microporiëntape van 1,25 cm en groei verticaal in de groeikamer (Figuur 2D) totdat de zaailingen 15-18 dagen na ontkieming klaar zijn om in potten te worden overgebracht (tabel 2). 3. Voorbereiding van het hydrocultuursysteem: potopstelling Voeg 150 ml schone glazen kralen van 5 mm toe aan elke schone pot en sluit af met het deksel (Figuur 1A).LET OP: In dit protocol zijn 5 mm glaskralen geschikt voor de meeste soorten22, maar de kraalmaat kan desgewenst worden aangepast. Plaats voldoende aluminiumfolie over de gesloten potten om de overgang tussen deksel en pot en autoclaaf te bedekken (121 °C gedurende 20 min) (Figuur 1B). Houd de voorbereide potten afgedekt totdat de planten klaar zijn om te worden overgebracht (tabel 2). 4. Voorbereiding van hydrocultuursysteem: toevoeging van zaailingen Wanneer de zaailingen klaar zijn om in potten te worden overgebracht (tabel 2), verwijdert u de aluminiumfolie en deksels van de potten in de steriele bank. Als de potten met bacteriën moeten worden geïnoculeerd, voer dan de volgende stappen uit voordat u doorgaat naar stap 4.3; Sla anders stap 4.2 over.Pluk met behulp van een steriele inoculatielus afzonderlijke kolonies uit zuivere bacterieculturen op agarplaten en suspendeer ze in 750 μL steriele 10 mM MgCl2. Herhaal dit totdat de oplossing troebel is. Optioneel: Was de suspensie 3x met 750 μL steriele 10 mM MgCl2 bij 5 min centrifugeren bij 1.000 × g en kamertemperatuur, gevolgd door het verwijderen van het supernatans en resuspensie van de pellet in 750 μL 10 mM MgCl2. Facultatief: Als u verschillende bacteriesoorten ent, meng dan de suspensies van enkelvoudige stammen die in de stappen 4.2.1-4.2.2 zijn bereid in gelijke verhoudingen alvorens verder te gaan. Pas de optische dichtheid bij een golflengte van 600 nm (OD600) aan op 0,2-0,4 in 0,5x MS-medium (pH 5,7 tot 5,9, aangepast met KOH) of een ander groeimedium naar keuze (zie stap 4.3). Meet de OD600 opnieuw om te controleren of de oplossing correct is verdund.LET OP: KOH is bijtend; Draag handschoenen en een laboratoriumjas. Verdun de suspensie verder tot OD600 0,002-0,004 in hetzelfde medium (verdunning 1:100).OPMERKING: De uiteindelijke celdichtheid hangt af van de gebruikte bacteriestam, maar in onze ervaring komt dit inoculum overeen met ongeveer 3-6 × 105 cellen ml-1. Voeg 35 ml van de uiteindelijke verdunning per potje toe. Voeg 35 ml steriel groeimedium toe om de potten onder controle te houden. Roer de kralen om ze gelijkmatig te bedekken met 0,5x MS-media voordat de plant wordt overgebracht, zodat de wortels niet uitdrogen. Ga verder met stap 4.4. Voeg 35 ml 0,5x MS medium toe aan elke pot (pH 5,7 tot 5,9, aanpassen met KOH). Roer de kralen om ze gelijkmatig te bedekken met 0,5x MS-media voordat de plant wordt overgebracht, zodat de wortels niet uitdrogen.OPMERKING: Het groeimedium kan worden gewijzigd, bijvoorbeeld door het verwijderen van voedingsstoffen, het toevoegen van osmolyten om zoutstress te induceren, of het gebruik van verschillende pH-waarden of groeimedia. LET OP: KOH is bijtend; Draag handschoenen en een laboratoriumjas. Plaats 3-5 A. thaliana planten in een pot door het wortelstelsel tussen de glaskralen te plaatsen.OPMERKING: Het aantal planten per pot is verschillend voor andere soorten (tabel 2). Beweeg de kralen rond met een steriele tang of lepel om de wortels te bedekken en til de bladeren uit het medium (Figuur 1C).NOTITIE: Verplaats de planten en kralen voorzichtig om te voorkomen dat de wortels breken en de planten gestrest raken. Breng 2 stroken microporiëntape van 1.25 cm aan over de bovenkant van de potten en plaats het deksel er voorzichtig op (Figuur 1D-F).NOTITIE: Duw het deksel niet naar beneden om te voorkomen dat de luchtuitwisseling wordt belemmerd. Bedek de opening tussen het deksel en de pot met 2,5 cm microporiëntape om de steriliteit te behouden en tegelijkertijd luchtuitwisseling mogelijk te maken, en plaats de potten in een groeikamer (Figuur 1G,H). Zet 4-8 potten per experimentele conditie, afhankelijk van de biologische vraag en de verwachte variabiliteit. Zorg ervoor dat u biologische negatieve controles opneemt (bijv. potten zonder planten) om rekening te houden met de metabolietachtergrond van het experimentele systeem. Stel hetzelfde aantal replicaten in voor negatieve controles als voor experimentele behandelingen (bijv. viervoudigingen). Vervang voor langere groeiperioden het groeimedium wekelijks: verwijder de rest van het groeimedium met een volumetrische pipet van 25 ml en voeg 35 ml vers medium toe. 5. Verzameling van wortelexsudaten Wanneer de planten de gewenste leeftijd hebben bereikt, verwijdert u de 2,5 cm microporiëntape en het deksel in de steriele bank.OPMERKING: Voor A. thaliana in onze groeiomstandigheden staat 21 dagen na ontkieming voor een volwassen vegetatieve fase voor het begin van de bloei. Het stadium van vegetatieve ontwikkeling is specifiek voor de plantensoort en de timing van de groeiperiode verandert met de plantensoort; Afhankelijk van de onderzoeksvraag kan deze timing worden aangepast. Voor steriliteitstesten aliquot 20 μL groeimedium en pipettet op LB-agarplaten.Voor geënte potten, aliquot 100 μL groeimedium om te gebruiken voor tellingen van kolonievormende eenheden (CFU) (bijv. in een verdunningsreeks23).OPMERKING: In onze ervaring variëren bacteriële dichtheden binnen 105-10 8 levende cellen ml-1 van groeimedium. Verwijder zoveel mogelijk groeimedium met een volumetrische pipet van 25 ml, om schade aan de wortels te voorkomen. Voeg 50 ml opvangmedium toe (bijv. 20 mM ammoniumacetaat; pH 5,7-5,9 aangepast met HCl) door langs de wanden van de pot te pipetteren om te voorkomen dat de bladeren nat worden. Sluit de potten met deksels en incubeer ze in steriele omstandigheden gedurende de gewenste tijd van exsudaatverzameling. Voor tijdgevoelige experimenten is 2 uur een goed verzamelvenster.LET OP: HCl is corrosief; Draag handschoenen en een laboratoriumjas. Voor langere verzameltijden van wortelexsudaat wikkelt u de deksels opnieuw in met tape en verplaatst u de potten naar de groeikamer. Verwijder na 2 uur de gewenste hoeveelheid opvangmedia in buisjes (bijv. 50 ml voor assays of analyses met geconcentreerde exsudaten, of 2 ml voor direct gebruik). Bewaar de verzamelde wortelexudaten bij -80 °C tot verdere verwerking of analyse.Centrifugeer bij het werken met geënte potten de verzamelde exsudaten gedurende 10 minuten bij 5.000 × g en 4 °C en gebruik alleen supernatanten voor de analyse. U kunt de exsudaten ook filtersteriliseren met een filter van 0,22 μm of 0,45 μm. Als het experiment deel uitmaakt van een tijdreeks, verwijder dan al het resterende opvangmedium uit potten en voeg 35 ml 0,5x MS-medium toe. Plaats het deksel en de tape van 2,5 cm terug voordat u de potten terugplaatst in de kweekkamer. Meet de wortel en schiet het verse gewicht van alle planten in één pot om later het wortelexudaat te normaliseren op basis van het plantgewicht.OPMERKING: Plantenweefsels kunnen desgewenst ook worden bemonsterd. 6. Verwerking van wortelexsudaten voor massaspectrometrie Afhankelijk van de analysemethode vriesdroogt u het wortelexsudaten om het te concentreren en verwijdert u het verzamelmedium (-80 °C bij 0,37 mbar totdat er geen vloeistof meer aanwezig is). Bewaren bij -80 °C tot klaar om te analyseren.OPMERKING: De hier gepresenteerde gegevens zijn gegenereerd met flow-injectie TOF-MS-analyse op een quadrupolair time-of-flight-instrument met nauwkeurige massa. Vóór de injectie in het analyse-instrument gevriesdroogde exsudaten reconstitueren of onbewerkte wortelexsudaten verdunnen met verzamelmedium naar gelang van het verse gewicht van de wortel.OPMERKING: Het verzamelmedium is gekozen om compatibel te zijn met de massaspectrometer. Afhankelijk van de analysemethode kunnen echter ontzoutingsstappen nodig zijn voordat de injectie wordt geïnjecteerd.

Representative Results

Het experimentele systeem dat hier wordt geïntroduceerd, maakt het mogelijk om experimentele en omgevingsfactoren te beheersen die de wortelexsudatieprofielen veranderen. We vergeleken de groei van A. thaliana onder verschillende lichtomstandigheden, plantleeftijd en plantdichtheden in twee verschillende laboratoria (Figuur 3). Planten zagen er gezond uit in alle laboratoria (Figuur 3A,B). Kortedagomstandigheden (10 uur licht vs. 16 uur licht, Figuur 3) resulteerden in een hogere wortelmassa in vergelijking met lange dagen (Figuur 3C,D). Evenzo was de totale wortelmassa van alle planten die in langedagomstandigheden werden gekweekt kleiner dan in kortedagomstandigheden (figuur 3C). Over het algemeen was de variabiliteit van de groei binnen en tussen potten laag in alle laboratoria. Het glazen pottensysteem is compatibel met een verscheidenheid aan plantensoorten en ontwikkelingsstadia. Het eindpunt voor wortelexsudaatanalyse is doorgaans 21 dagen, omdat in onze experimentele omstandigheden veel plantensoorten zich in een volwassen vegetatief stadium bevinden voordat ze overgaan naar het voortplantingsstadium (Figuur 4A-E). Planten kunnen eenvoudig uit het experimentele systeem worden verwijderd zonder zichtbare schade aan het wortelstelsel. Het bepalen van weefselgewichten of het gebruik van weefsels voor stroomafwaartse analyse is dus eenvoudig. De hoogste scheutgewichten werden gevonden voor tarwe, gevolgd door sorghum en tomaat. De hoogste wortelgewichten werden gevonden voor sorghum, gevolgd door tarwe en M. truncatula. De wortel:scheutverhouding verschilt per soort. Over het algemeen varieerden de weefselgewichten tussen 100 mg en 800 mg. Een centraal aspect van experimentele systemen die het verzamelen van wortelexsudaat mogelijk maken, is de gecontroleerde inoculatie met microben om plant-microbe-interacties in een gedefinieerde omgeving te bestuderen. Het gepresenteerde experimentele systeem kan zelfs met herhaalde manipulatie steriel worden gehouden (zie ‘controle’-toestand in figuur 5), en bacteriën kunnen worden toegevoegd en gedurende langere perioden in stand worden gehouden. Toen 33 dagen oude A. thaliana planten werden geïnoculeerd met een mengsel van commensale bacteriën bij OD600 0,004, bleven de bacteriën 12 dagen bestaan, wat de volledige duur van het experiment was (Figuur 5). Kolonievormende eenheden namen zelfs 100 keer toe in het groeimedium en koloniseerden ook de wortels (Figuur 5C). Fenotypen van geënte planten waren niet te onderscheiden van die van steriele planten (figuur 5A,B). Het gepresenteerde experimentele systeem maakt het mogelijk om exsudaat te verzamelen in veel experimentele omstandigheden. Hier presenteren we exsudatieprofielen van A. thaliana Col-0 verzameld in ammoniumacetaat of in water van dezelfde planten achtereenvolgens (Figuur 6A). Exsudaten werden opgeslagen bij -80 °C tot analyse, genormaliseerd op basis van wortelgewicht en geanalyseerd met massaspectrometrie. Monsters van potten met planten werden gefilterd tegen experimentele controles (potten zonder planten). Van de 2.163 metabolieten vertoonden er 436 een signaal boven de achtergrond (20,16%) en werden bewaard voor analyse. Hiervan vertoonden 416 of 95% van de verbindingen een duidelijke abundantie tussen de experimentele omstandigheden. 26 metabolieten konden echter aan geen enkele verbinding worden toegeschreven en zijn dus niet gedefinieerd. De meeste metabolieten (406 of 98%) waren overvloediger aanwezig in door water verzamelde exsudaten. De opeenvolgende verzameling van exsudaten, eerst in ammoniumacetaat en later in water, kan het exsudatieprofiel beïnvloeden, aangezien metabole signalen in de loop van de tijd kunnen verdunnen. Het bijna uitsluitend hogere exsudatiesignaal in water dat als tweede tijdstip wordt opgevangen, ondersteunt deze hypothese echter niet: exsudaatverzameling in zuiver water veroorzaakt waarschijnlijk een osmotische schok voor planten, die de verhoogde metabolietabundanties veroorzaakt in vergelijking met een verzameloplosmiddel dat equimolair is aan de groeioplossing (20 mM ammoniumacetaat is equimolair tot 0,5x MS-medium). Onderzoek naar chemische klassen van geïdentificeerde verbindingen van beide groeiomstandigheden toonde aan dat de meerderheid van de verbindingen organische zuren en derivaten zijn (28,6%), gevolgd door organische zuurstofverbindingen (18%), organoheterocyclische verbindingen (14,2%) en lipiden (13,2%). Slechts een kleine subset van metabolieten behoort tot fenylpropanoïden en polyketiden (8,7%) en benzenoïden (6%). Organische stikstofverbindingen, nucleosiden, organozwavelverbindingen, alkaloïden, lignanen en verwante verbindingen vertegenwoordigen tussen 2% en 0,5% van de geclassificeerde verbindingen (figuur 6B). De hier afgebeelde verdeling van metabolieten komt overeen met reeds gepubliceerde gegevens met behulp van andere soorten verzamelsystemen voor wortelexsudaten24. Figuur 1: Opstelling glazen pot. (A) Pot met glaskralen. (B) Pot met glaskralen klaar om te worden geautoclaveerd. (C) Zaailingen in potten (bovenaanzicht). (D) Zaailingen in een pot (bovenaanzicht) met 1,25 cm micropore tape. (E) Zaailingen in potten (zijaanzicht) met 1,25 cm microporiëntape. (F) Zaailingen in potten (zijaanzicht) met 1,25 cm microporiëntape en deksel. (G) Volledige potopstelling met zaailingen in potten (zijaanzicht) met 1,25 cm microporiëntape, deksel en 2,5 cm microporiëntape. (H) Voltooi de opstelling van de pot (bovenaanzicht). (I) Planten 21 dagen oud en klaar voor de oogst (bovenaanzicht). Potmaat 147 mm hoog x 100 mm diameter. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 2: Aan de oppervlakte gesteriliseerde zaailingen op 0,5x Murashige en Skoog medium agar platen in een groeikamer. (A) Arabidopsis thaliana (6 dagen oud), (B) Brachypodium distachyon (6 dagen oud), (C) Medicago truncatula (6 dagen oud), (D ) A. thaliana (18 dagen oud). Afmeting agarplaat 120 mm x 120 mm. Klik hier voor een grotere versie van deze figuur. Figuur 3: Arabidopsis thaliana Col-0 planten gekweekt in potten onder korte- en langedaglichtomstandigheden. (A) Pot met drie planten van 33 dagen oud gekweekt in kortedagomstandigheden (10 uur licht/14 uur donker, 220 μmol m-2 s-1 lichtintensiteit, 21 °C dag/18 °C nacht) en (B) pot met vijf planten van 21 dagen oud gekweekt in lange dagomstandigheden (16 uur licht/8 uur donker, 150-160 μmol m-2 s-1 lichtintensiteit, 22 °C dag/18 °C nacht). Wortelgewicht van (C) alle planten van één pot en (D) van enkele planten. ** vertegenwoordigen significantiewaarden van de T-toets (p < 0,05). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 4: Vijf fylogenetisch verschillende soorten op dag 21 in de opstelling van het steriele glazen pottensysteem. (A) Model eenzaadlobbige Brachypodium distachyon, (B) model peulvrucht Medicago truncatula, (C) tweezaadlobbige Solanum lycopersicum (tomaat), (D) tweezaadlobbige Sorghum bicolor, (E) eenzaadlobbige Triticum aestivum (tarwe). (F) Vers gewicht van wortels en scheuten van de soort die in glazen potten zijn gekweekt. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 5: Arabidopsis thaliana Col-0 (33 dagen oud) gekweekt in kortedagomstandigheden. (A) In een steriele opstelling of (B) gedurende 12 dagen geïnoculeerd met een consortium van commensale bacteriën. (C) Kolonievormende eenheden voor steriele (controle) en geënte potten van het groeisubstraat (links) en de wortel (rechts). N = 4 potten voor de steriele controleconditie en n = 8 potten voor de geïnoculeerde conditie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Figuur 6: Verschillende wortelexsudaatprofielen voor 21 dagen oude A. thaliana Col-0. Exsudaten werden gedurende 2 uur verzameld in steriel 20 mM ammoniumacetaat (pH 5,7), gevolgd door 2 uur opvang in steriel gefilterd gedeïoniseerd water. Metabolieten werden gedetecteerd door middel van massaspectrometrie met behulp van directe injectie. (A) Analyse van de hoofdcomponenten van 436 metabolieten gedetecteerd boven het achtergrondniveau (vergelijking van potten met planten met potten zonder planten). PC: hoofdcomponent met uitleg over de mate van variantie. Blauw: door water opgevangen exsudaten, geel: door ammoniumacetaat verzamelde exsudaten. (B) Cirkeldiagram van 416 metabolieten die significant verschillen tussen experimentele omstandigheden (Tukey-test) gekleurd volgens de superklasse (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken. Soort Zaad voorbereiding Tijd in 70% ethanol (min) Concentratie van natriumhypochloriet (NaClO) (v/v % bleekmiddel) Tijd in bleekmiddel (min) Thaliana van Arabidopsis 15 Geen; 100% ethanol 15 Brachypodium distachyon* Schil 0.5 6 5 Medicago truncatula*a 30 6 30 Solanum lycopersicum* 0.5 6 5 Sorghum bicolor* Schil 0.5 6 30 Triticum aestivum* Schil 0.5 12 20 Tabel 1: Sterilisatiemethoden voor oppervlaktezaden voor meerdere soorten. *4-5x gewassen met gefilterd gedeïoniseerd water tussen ethanol en bleekmiddel en aan het einde; eenincubatie gedurende 3-6 uur na bleekmiddel, elke 30 minuten vervangen door gefilterd gedeïoniseerd water. Soort Dag naar potten Aantal planten Brachypodium distachyon 4 tot 5 3 Sorghum tweekleurig 4 tot 5 3 Aestivum van Triticum 4 tot 5 2 Medicago truncatula 5 tot 6 3 Solanum lycopersicum 7 tot 8 3 Thaliana van Arabidopsis 17 3 tot 5 Tabel 2: Leeftijd van zaailingen in dagen voor overdracht naar potten en aantal planten per pot voor verschillende plantensoorten.

Discussion

Het hier gepresenteerde experimentele systeem is gebaseerd op glazen potten en glaskralen en biedt dus een eenvoudig, onderhoudsarm en veelzijdig semi-hydrocultuursysteem om wortelexsudatie in verschillende contexten te bestuderen. Het is gebruikt in studies naar de exsudatieprofielen van verschillende plantensoorten²⁵, de reacties van exsudatie op verschillende groeiomstandigheden²⁵, evenals de invloed van fysiochemische eigenschappen van de bodem op exsudatie²². Het systeem is geschikt voor alle hier geteste plantensoorten voor langere groeiperioden, variërend van weken tot maanden. Het handhaven van steriele omstandigheden is eenvoudig, net als de inenting met bacteriën, die aanhouden gedurende de geanalyseerde groeiperiode van 2 weken. Het experimentele systeem maakt dus niet alleen een gecontroleerde verzameling wortelexudaten in steriele omstandigheden mogelijk, maar kan ook worden gebruikt om plant-microbe-interacties te bestuderen. Bovendien kunnen de plantengroeimedia worden gevarieerd om metabolische reacties op verschillende voedingsniveaus te bestuderen, en kunnen groeiperioden worden aangepast door de lichtomstandigheden aan te passen of potten van verschillende grootte te gebruiken.

Het bestuderen van wortelexsudaten in hydrocultuur of semi-hydrocultuur blijft standaard in het veld, voornamelijk vanwege de verbeterde resolutie van metabolieten met een lage concentratie¹¹. Veel hydrocultuurbenaderingen zijn gebaseerd op petrischalen, borden met meerdere putten of andere kleine containers die steriliteit en een hoge doorvoer mogelijk maken, maar experimenten beperken tot kleine planten of zaailingen die worden gekweekt in omgevingen met een hoge luchtvochtigheid 17,18,26,27. In de gepresenteerde opstelling met glazen potten wordt voldoende hoofdruimte geboden door de relatief grote potten, waardoor langere groeiperioden mogelijk zijn. Micropore tape strepen zorgen voor luchtuitwisseling met behoud van steriliteit. Zo kunnen zelfs hoge eenzaadlobbigen zoals gerst en maïs meerdere weken in de opstelling met glazen potten worden gekweekt. Kleine planten zoals A. thaliana en klaver kunnen 4-5 weken na ontkieming worden bestudeerd, inclusief vegetatieve en reproductieve stadia.

Alternatieve hydrocultuuropstellingen zijn ook beschikbaar voor grotere planten, maar deze vereisen vaak op maat gemaakte dozen en inlaten gemaakt van gaas, schuimplaten en implantaatmanden voor plantondersteuning 15,28,29,30. Bovendien zijn deze apparaten meestal niet steriel ingesteld, of vereisen ze uitdagende installatie- en onderhoudsprocedures om ze vrij te houden van microbiële en/of chemische verontreinigingen. Het instellen en handhaven van steriliteit in het gepresenteerde experimentele systeem is eenvoudig. Bovendien vermindert het gebruik van glas voor potten en kralen de aanwezigheid van verontreinigingen die uit kunststoffen lekken en bespaart het hulpbronnen omdat het gemakkelijk kan worden gewassen en hergebruikt.

Glasparels zijn al eerder toegepast om bodemdeeltjes na te bootsen. Ze induceren de natuurlijke wortelontwikkeling in bemonsteringsapparaten voor wortelexsudatie, zoals exsudatievallen³¹ of andere semihydrocultuursystemen¹⁹. De opstelling van de glazen pot maakt gebruik van deze ontwikkeling en introduceert de kralen als kolonisatieoppervlak voor microben. In de bodem evolueert het microbioom rond plantenwortels in een halfvaste omgeving, met compacte deeltjes en ruimtes gevuld met lucht of water. Hoewel de opstelling van de glazen pot geen actieve beluchting van het groeimedium bevat, waardoor de onderste vloeibare fase waarschijnlijk geen optimaal zuurstofgehalte bevat, creëert de combinatie van een groter parelvolume met een kleiner volume van het groeimedium een vochtige maar beluchte bovenste fase waarin microben kunnen groeien onder oxische omstandigheden. Anderen hebben voorgesteld om groeicontainers^26,28 te schudden of slangen te gebruiken die zijn gekoppeld aan luchtpompen^19,29 om de luchttoevoer in hydrocultuurgroeisystemen op peil te houden. Die systemen zijn echter zo ingesteld dat ze niet steriel zijn, of vereisen gespecialiseerd materiaal en constant toezicht om de steriliteit te behouden. Bovendien, in het geval van schudden, veel zorg om onderdompeling van scheuten in groeioplossingen en schade aan wortelsystemen te voorkomen. Niettemin kan de gepresenteerde experimentele opstelling, indien gewenst, worden aangepast met extra materiaal voor beluchting.

Een cruciaal aspect om rekening mee te houden in alle onderzoeken naar plant-microbe-interacties die het metabolisme onderzoeken, is dat microben plantaardige verbindingen afbreken en zelf metabolieten produceren. Zonder een gespecialiseerde steriele proefopstelling is het niet mogelijk om onderscheid te maken tussen plantaardige en microbe-afgeleide metabolieten. Om microbiële activiteit te remmen en plantaardige verbindingen te verrijken, stelden Oburger et al. voor om de bemonsteringsoplossing van het wortelexsudaat chemisch te steriliseren om bacteriële afbraak te remmen³². Het effect van chemische remmers kan worden bestudeerd in het gepresenteerde experimentele systeem, waarbij exsudatieprofielen van steriele versus niet-steriele planten die met of zonder de remmer worden behandeld, worden vergeleken.

Een belangrijke beperking van de gepresenteerde opstelling van glazen potten is dat de groeiomstandigheden erg kunstmatig blijven in vergelijking met aarde. Exsudaten van in aarde gekweekte planten worden vaak verzameld uit percolatiesystemen¹³, waar oplosmiddelstromen worden verzameld aan de basis van groeicontainers, of in bodem-hydrocultuurhybride systemen, waarbij planten in eerste instantie in aarde worden gekweekt en vervolgens worden overgebracht naar hydrocultuuromstandigheden^16,33. In tegenstelling tot de opstelling van een glazen pot, zijn deze procedures meestal destructief, waardoor er in de loop van de tijd geen meerdere verzamelingen mogelijk zijn in veranderende groeiomgevingen. Bovendien, terwijl in percolerende systemen de bodemachtergrond samen met de exsudaten wordt bemonsterd, wordt in bodem-hydrocultuurhybride systemen het probleem van een hoge bodemmetabolische achtergrond omzeild door over te schakelen naar hydrocultuuromstandigheden voor het verzamelen van exsudaat. Hoewel hersteltijden zijn geïmplementeerd om metabolietlekkage via gewonde wortels te verminderen¹¹, is de overdracht van planten zeer storend en zullen wonden waarschijnlijk aanhouden, en kan het metabolisme van de plant veranderen als reactie op overdracht naar hydrocultuuromstandigheden. Bovendien wordt in veel gevallen een osmotische schok veroorzaakt door planten over te brengen naar water in plaats van een geschikte groeioplossing ^16,33. In het gepresenteerde protocol wordt de groeioplossing uitgewisseld met een equimolaire oplossing om het osmotische evenwicht te behouden, waardoor exsudatie nog steeds binnen een kort, gedefinieerd tijdsbestek kan worden vastgelegd. De verandering van groeioplossing is gebruikelijk in veel gepubliceerde onderzoeken en kan gemakkelijk worden bereikt in hydrocultuuropstellingen zonder wortelwond 12,16,26,34. Door zijn veelzijdigheid kan het gepresenteerde experimentele systeem gemakkelijk worden aangepast om meer natuurlijke omstandigheden na te bootsen, bijvoorbeeld door steriel of niet-steriel bodemextract te gebruiken als groeioplossing met of zonder de aanwezigheid van vaste gronddeeltjes. De geleidelijke overgang naar natuurlijke omstandigheden maakt het mogelijk om de impact van de verschillende fysisch-chemische bodemeigenschappen en microbiële aanwezigheid op het metabolisme en de fysiologie van planten te bestuderen. Voordat de wetenschappelijke gemeenschap een goed begrip heeft van exsudatie in verschillende omgevingen, is het wenselijk om op aarde gebaseerde en hydrocultuursystemen parallel te gebruiken, aangezien beide opstellingen hun voordelen en beperkingen hebben¹³.

Concluderend valt de gepresenteerde semihydroponische, op glas gebaseerde experimentele opstelling op door zijn eenvoud in combinatie met een hoge veelzijdigheid aan toepassingen. Het biedt een toegankelijke, goedkope manier om exsudatie te verzamelen en te bestuderen in steriele omstandigheden, of in combinatie met microben en plant-microbe-interacties.

Materials

Agar powder for bacteriology	VWR	20767.298
Aluminum foil	FORA GmbH
Ammonium acetate	Sigma-Aldrich	32301-1KG	ACS reagent, Eur >- 98%
Autoclave VX-150	Systec	1150
Balance	Sartorius	QUINTIX64-1S
Centrifuge	Hermle Labortechnik GmbH	305.00 V05
Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Difco LB Broth, Lennox	BD	240210
Ethanol	Reuss-Chemie AG	RC-A15-A-005L
Filtered deionized water	Merck Millipore	Milli-Q IQ7000
Glass beads	Carl Roth	HH56.1	5 mm
Hydrochloric acid	Merk	1.00317.1000
Inoculation loop	Karl Hammacher GmbH	HWO_070-21
Jars	Weck	105741	850 mL
Lyophilizer	Christ	Alpha 2-4 LSCplus
Magnesium chloride hexahydrate	Carl Roth	2189.1
Matrix Orbital thermoshaker	IKA	10006248
Microcentrifuge tube	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500	SafeSeal reaction tube, 2 mL, PP
Micropore tape	3M	1530-0	1.25 cm x 9.1 m
Micropore tape	3M	1530-1	2.5 cm x 9.1 m
Murashige & Skoog Medium (MS)	Duchefa Biochemie	M0221.0050
Growth chamber	Percival	SE41-TLCU4	16 hour light/8 dark. 22 °C day/18 night
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Potassium hydroxide	Sigma-Aldrich	8.14353.0100
SmartSpec Plus Spectrophotometer	Bio-Rad	170-2525
Sodium hypochlorite solution, 12% Cl	Carl Roth	9062.4
Square petri dish	Greiner Bio-One	688102	120x120x17 mm, with vents
Stericup Quick release	Millipore	S2GPU05RE	0.22 µm PES, 500 mL
Sterile bench	FASTER S.r.l.	FlowFast H 18