Summary

Nicht-invasiver Assay zur Bestimmung der Chlorophyll-Biosynthese-Kinetik in frühen Stadien der Arabidopsis-De-etiolation

Published: January 12, 2024
doi:

Summary

Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung. Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.

Abstract

Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der Entetiolierung, einer der dramatischsten Phasen im Lebenszyklus der Pflanze. Der streng kontrollierte und hochdynamische Prozess der Chlorophyllbiosynthese wird bei Blütenpflanzen beim Übergang vom Dunkeln zum Hellen ausgelöst. In dem Moment, in dem etiolierte Sämlinge den ersten Spuren von Sonnenlicht ausgesetzt sind, wird die schnelle Umwandlung (in Sekundenordnung) von Protochlorophyllid in Chlorophyllid durch einzigartige lichtakzeptierende Proteinkomplexe vermittelt, die über nachfolgende Stoffwechselschritte zur Produktion von voll funktionsfähigem Chlorophyll führen. Zu den Standardtechniken für die Analyse des Chlorophyllgehalts gehört die Pigmentextraktion aus abgelöstem Pflanzengewebe, was für die Untersuchung solch schneller Prozesse nicht gilt. Um die Chlorophyllkinetik in vivo mit hoher Genauigkeit und raumzeitlicher Auflösung in den ersten Stunden nach der lichtinduzierten Deetiolierung zu untersuchen, wurden ein Instrument und ein Protokoll entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren vor, das für eine statistisch robuste Quantifizierung von Chlorophyll in den frühen Stadien der Arabidopsis-De-Etiolierung entwickelt wurde.

Introduction

Die De-etiolation stellt die dramatischste Phase im Pflanzenlebenszyklus dar, die durch eine Reihe morphologischer Veränderungen und eine vollständige Neuordnung des Pflanzenstoffwechsels (von hetero- zu autotrop) gekennzeichnet ist1. Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der lichtinduzierten Entetiolierung in Pflanzen und ein sehr dynamischer Prozess. Die Bildung von Chlorophyll aus dunkel produzierten Vorläufer-Protochlorophyllid muss eng koordiniert werden, um Schäden durch reaktive Nebenprodukte zu vermeiden2. Die Protochlorophyllidreduktion zu Chlorophyllid wird durch lichtabhängige Protochlorophyllid-Oxidoreduktasen (PORs) katalysiert, einzigartige Enzyme, die direkt durch Licht aktiviert werden. Die Reaktion ist sehr schnell und findet in der Größenordnung von ms biss 3 statt, was zu einer erkennbaren Chlorophyllakkumulation innerhalb von Minuten nach etiolierter Keimlingsbestrahlung führt 4,5,6. Für die Chloroplastenbiogenese ist mehr Zeit (von Stunden bis Tagen) erforderlich, um einen voll funktionsfähigen Photosyntheseapparat zu etablieren3.

Zur Analyse des Chlorophyllgehalts gibt es verschiedene Methoden, darunter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Spektrophotometrie. Normalerweise erfordern diese Techniken die Zerstörung von Pflanzengewebe 4,5,6, was die Bestimmung von Veränderungen des Chlorophyllgehalts im Laufe der Zeit einschränkt. Methoden, die eine nicht-invasive Chlorophyllkinetik ermöglichen, können eine völlig neue Perspektive eröffnen, um Pflanzen in verschiedenen Aspekten zu untersuchen, die von grundlegenden Forschungsfragen wie der Analyse des Prozesses der Chlorophyllsynthese in Zeit und Raum bis hin zu praktischeren Anwendungen wie der Bewertung der Stresstoleranz oder der Wirkung von Biostimulanzien auf die Chlorophyllkinetik reichen. Vor diesem Hintergrund haben wir ein System zur Überwachung der Chlorophyllbildung eingeführt, iReenCAM7. Es umfasst eine CCD-Kamera, Emissionsfilter, Lichtquellen und eine Pipeline für die automatisierte Fluoreszenzanalyse (Abbildung 1). Das Hauptmerkmal des entwickelten Geräts ist eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, die die in aktuellen Ansätzen verwendeten Parameter übertrifft, sowie eine ausreichende Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Standardanalysemethoden7.

Das hier beschriebene nicht-invasive Verfahren erfordert ein Minimum an Reagenzien und umfasst einfache Schritte, die es ermöglichen, ein Chlorophyll-Kinetikprofil in lebenden Arabidopsis-Sämlingen in sehr frühen Stadien der Entetiolierung zu erhalten. Das Protokoll kann für die Untersuchung des hochdynamischen Prozesses der Chlorophylsynthese nützlich sein, der von einer Reihe von Faktoren beeinflusst wird, sowohl exogen (Salz, Dürre, Biostimulanzien, Schwermetalle usw.) als auch endogen (typischerweise verbunden mit Veränderungen in der Genaktivität) im Ursprung, ohne dass Pflanzengewebe abgelöst werden muss, wodurch zusätzlicher Stress vermieden wird.

Protocol

1. Mittlere Zubereitung Bereiten Sie das Kulturmedium vor, indem Sie 0,75 g Geliermittel mit 50 ml sterilem deionisiertem Wasser in einer Glasflasche mischen, um eine Konzentration von 1,5 % (w/v) für eine Petriplatte (120 x 120 x 17 mm) zu erreichen. Schütteln Sie die Mischung vorsichtig und erhitzen Sie sie dann in der Mikrowelle, bis sie kocht, um das Geliermittel aufzulösen (die Lösung wird klar). Lassen Sie das Medium auf 58-60 °C abkühlen, bevor Sie mit den nächsten Schri…

Representative Results

Der typische Output, der mit dem neu entwickelten Verfahren in den 4 Tage alten entetiolierten Arabidopsis-Sämlingen des Wildtyps (WT), Ökotyp Columbia-0 (Col-0) erzielt wurde, ist in Abbildung 3 dargestellt. Unter Kontrollbedingungen (DMSO-supplementierte MS-Medien) beginnt die Chlorophyll-Biosynthesekurve mit einem anfänglichen Ausbruch der Chlorophyllsynthese, bei dem der während der scotomorphogenen Phase des Wachstums synthetisierte Protochlorphyllidpool aufgrund der lichti…

Discussion

Kritische Schritte des Protokolls und Fehlerbehebung – kein Licht und kümmern Sie sich um die Maske
Wie direkt in der obigen Protokollbeschreibung hervorgehoben, ist es von entscheidender Bedeutung, selbst Spuren von Licht sowohl während der Kultivierung von etiolierten Pflanzensämlingen als auch kurz vor Beginn des Protokolls zu vermeiden11. In unserem Aufbau verwenden wir eine spezielle dunkle Kammer, die sich im begehbaren Phytotron befindet und durch eine lichtdichte Dre…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Diese Arbeit wurde durch das Europäische Fonds für regionale Entwicklung-Projekt SINGING PLANT (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Dieses Projekt wurde durch das Projekt MSCA4Ukraine (ID 1233580) gefördert, das von der Europäischen Union finanziert wird. Wir danken Lenka Sochurkova für die grafische Gestaltung von Abbildung 1.

Materials

6-benzylaminopurine Duchefa Biochemie B0904.0001
Aluminum foil Merck Z691577
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds NASC collection N1092
Cultivation chamber PSI custom made
Dimethilsulfoxid Thermo Fisher Scientific 042780.AK
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) Merck EP3123000063
Gelrite Duchefa Biochemie G1101
iReenCAM device PSI custom made/prototype
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL Merck Z305170-10EA
Laminar-flow box UniGreenScheme ITEM-31156
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch 3M Science. Applied to Life 7000006085
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND Merck BR780546-500EA
Micropore tape 3M Science. Applied to Life 7100225115
Osram lumilux green l18w/66 Ovalamp 200008833
Petri plates – Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented Merck Z617679-240EA
Pipet tips, 1000 μL, Axygen Merck AXYT1000B
The Plant Screen Data Analyzer software PSI delivered as a part of the iReenCAM

References

  1. Arsovski, A. A., Galstyan, A., Guseman, J. M., Nemhauser, J. L. Photomorphogenesis. Arabidopsis Book. 10, e0147 (2012).
  2. Reinbothe, S., Reinbothe, C., Apel, K., Lebedev, N. Evolution of chlorophyll biosynthesis–the challenge to survive photooxidation. Cell. 86 (5), 703-705 (1996).
  3. Heyes, D. J., et al. Photocatalysis as the ‘master switch’ of photomorphogenesis in early plant development. Nat Plants. 7 (3), 268-276 (2021).
  4. Hu, X. Y., Tanaka, A., Tanaka, R. Simple extraction methods that prevent the artifactual conversion of chlorophyll to chlorophyllide during pigment isolation from leaf samples. Plant Methods. 9 (1), 19 (2013).
  5. Chazaux, M., Schiphorst, C., Lazzari, G., Caffarri, S. Precise estimation of chlorophyll a, b and carotenoid content by deconvolution of the absorption spectrum and new simultaneous equations for chl determination. Plant J. 109 (6), 1630-1648 (2022).
  6. Marr, I. L., Suryana, N., Lukulay, P., Marr, M. I. Determination of chlorophyll-a and chlorophyll-b by simultaneous multicomponent spectrophotometry. Fresenius J Anal Chem. 352 (5), 456-460 (1995).
  7. Balakhonova, V., et al. Ireencam: Automated imaging system for kinetic analysis of photosynthetic pigment biosynthesis at high spatiotemporal resolution during early deetiolation. Front Plant Sci. 14, 1093292 (2023).
  8. Virgin, H. I., Kahn, A., Vonwettstein, D. The physiology of chlorophyll formation in relation to structural changes in chloroplasts. Photochem Photobiol. 2 (2), 83-91 (1963).
  9. Reinbothe, C., et al. Chlorophyll biosynthesis: Spotlight on protochlorophyllide reduction. Trends Plant Sci. 15 (11), 614-624 (2010).
  10. Kobayashi, K., Masuda, T. Transcriptional regulation of tetrapyrrole biosynthesis in arabidopsis thaliana. Front Plant Sci. 7, 1811 (2016).
  11. Wang, Y., Folta, K. M. Contributions of green light to plant growth and development. Am J Bot. 100 (1), 70-78 (2013).
  12. Brzezowski, P., Richter, A. S., Grimm, B. Regulation and function of tetrapyrrole biosynthesis in plants and algae. Biochim Biophys Acta. 1847 (9), 968-985 (2015).
  13. Pipitone, R., et al. A multifaceted analysis reveals two distinct phases of chloroplast biogenesis during de-etiolation in arabidopsis. eLife. 10, e62709 (2021).
  14. Stirbet, A. G. On the relation between the kautsky effect (chlorophyll a fluorescence induction) and photosystem ii: Basics and applications of the ojip fluorescence transient. J Photochem Photobiol B-Biol. 104 (1-2), 236-257 (2011).
  15. Kupper, H., et al. Analysis of ojip chlorophyll fluorescence kinetics and q(a) reoxidation kinetics by direct fast imaging. Plant Physiol. 179 (2), 369-381 (2019).
  16. Avin-Wittenberg, T., et al. Global analysis of the role of autophagy in cellular metabolism and energy homeostasis in arabidopsis seedlings under carbon starvation. Plant Cell. 27 (2), 306-322 (2015).
  17. Kósa, A., Preininger, &. #. 2. 0. 1. ;., Böddi, B. Nitrogen deficiency hinders etioplast development in stems of dark-grown pea (pisum sativum) shoot cultures. Physiol Plant. 155 (3), 330-337 (2015).
  18. Liang, Y., et al. A nondestructive method to estimate the chlorophyll content of arabidopsis seedlings. Plant Met. 13 (1), 26 (2017).
  19. Pérez-Patricio, M., et al. Optical method for estimating the chlorophyll contents in plant leaves. Sensors. 18 (2), 650 (2018).
  20. Spyroglou, I., et al. Mixed models as a tool for comparing groups of time series in plant sciences. Plants (Basel). 10 (2), (2021).
  21. Tanaka, R., Kobayashi, K., Masuda, T. Tetrapyrrole metabolism in arabidopsis thaliana. The Arabidopsis book / Am Soc Plant Biol. 9. 9, e0145 (2011).
  22. De Wit, M., Galvao, V. C., Fankhauser, C. Light-mediated hormonal regulation of plant growth and development. Annu Rev Plant Biol. 67, 513-537 (2016).
  23. Liu, X., Li, Y., Zhong, S. Interplay between light and plant hormones in the control of arabidopsis seedling chlorophyll biosynthesis. Front Plant Sci. 8, 1433 (2017).

Play Video

Cite This Article
Balakhonova, V., Pushkarova, N., Skalak, J., Dobisova, T., Benedikty, Z., Panzarova, K., Trtilek, M., Hejátko, J. Non-invasive Assay for Chlorophyll Biosynthesis Kinetics Determination during Early Stages of Arabidopsis De-etiolation. J. Vis. Exp. (203), e66087, doi:10.3791/66087 (2024).

View Video