Hier beschreiben wir ein fortschrittliches Werkzeug zur Überwachung der Chlorophyllbiosynthese in den frühen Stadien der Arabidopsis-Keimlingsentetiolierung. Die neuartige Methodik ermöglicht eine nicht-invasive Echtzeit-Chlorophyll-Fluoreszenz-Bildgebung mit hoher räumlicher und zeitlicher Auflösung.
Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der Entetiolierung, einer der dramatischsten Phasen im Lebenszyklus der Pflanze. Der streng kontrollierte und hochdynamische Prozess der Chlorophyllbiosynthese wird bei Blütenpflanzen beim Übergang vom Dunkeln zum Hellen ausgelöst. In dem Moment, in dem etiolierte Sämlinge den ersten Spuren von Sonnenlicht ausgesetzt sind, wird die schnelle Umwandlung (in Sekundenordnung) von Protochlorophyllid in Chlorophyllid durch einzigartige lichtakzeptierende Proteinkomplexe vermittelt, die über nachfolgende Stoffwechselschritte zur Produktion von voll funktionsfähigem Chlorophyll führen. Zu den Standardtechniken für die Analyse des Chlorophyllgehalts gehört die Pigmentextraktion aus abgelöstem Pflanzengewebe, was für die Untersuchung solch schneller Prozesse nicht gilt. Um die Chlorophyllkinetik in vivo mit hoher Genauigkeit und raumzeitlicher Auflösung in den ersten Stunden nach der lichtinduzierten Deetiolierung zu untersuchen, wurden ein Instrument und ein Protokoll entwickelt. Hier stellen wir ein detailliertes Verfahren vor, das für eine statistisch robuste Quantifizierung von Chlorophyll in den frühen Stadien der Arabidopsis-De-Etiolierung entwickelt wurde.
Die De-etiolation stellt die dramatischste Phase im Pflanzenlebenszyklus dar, die durch eine Reihe morphologischer Veränderungen und eine vollständige Neuordnung des Pflanzenstoffwechsels (von hetero- zu autotrop) gekennzeichnet ist1. Die Chlorophyllbiosynthese ist ein Kennzeichen der lichtinduzierten Entetiolierung in Pflanzen und ein sehr dynamischer Prozess. Die Bildung von Chlorophyll aus dunkel produzierten Vorläufer-Protochlorophyllid muss eng koordiniert werden, um Schäden durch reaktive Nebenprodukte zu vermeiden2. Die Protochlorophyllidreduktion zu Chlorophyllid wird durch lichtabhängige Protochlorophyllid-Oxidoreduktasen (PORs) katalysiert, einzigartige Enzyme, die direkt durch Licht aktiviert werden. Die Reaktion ist sehr schnell und findet in der Größenordnung von ms biss 3 statt, was zu einer erkennbaren Chlorophyllakkumulation innerhalb von Minuten nach etiolierter Keimlingsbestrahlung führt 4,5,6. Für die Chloroplastenbiogenese ist mehr Zeit (von Stunden bis Tagen) erforderlich, um einen voll funktionsfähigen Photosyntheseapparat zu etablieren3.
Zur Analyse des Chlorophyllgehalts gibt es verschiedene Methoden, darunter Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) oder Spektrophotometrie. Normalerweise erfordern diese Techniken die Zerstörung von Pflanzengewebe 4,5,6, was die Bestimmung von Veränderungen des Chlorophyllgehalts im Laufe der Zeit einschränkt. Methoden, die eine nicht-invasive Chlorophyllkinetik ermöglichen, können eine völlig neue Perspektive eröffnen, um Pflanzen in verschiedenen Aspekten zu untersuchen, die von grundlegenden Forschungsfragen wie der Analyse des Prozesses der Chlorophyllsynthese in Zeit und Raum bis hin zu praktischeren Anwendungen wie der Bewertung der Stresstoleranz oder der Wirkung von Biostimulanzien auf die Chlorophyllkinetik reichen. Vor diesem Hintergrund haben wir ein System zur Überwachung der Chlorophyllbildung eingeführt, iReenCAM7. Es umfasst eine CCD-Kamera, Emissionsfilter, Lichtquellen und eine Pipeline für die automatisierte Fluoreszenzanalyse (Abbildung 1). Das Hauptmerkmal des entwickelten Geräts ist eine hohe räumliche und zeitliche Auflösung, die die in aktuellen Ansätzen verwendeten Parameter übertrifft, sowie eine ausreichende Sensitivität und Spezifität im Vergleich zu Standardanalysemethoden7.
Das hier beschriebene nicht-invasive Verfahren erfordert ein Minimum an Reagenzien und umfasst einfache Schritte, die es ermöglichen, ein Chlorophyll-Kinetikprofil in lebenden Arabidopsis-Sämlingen in sehr frühen Stadien der Entetiolierung zu erhalten. Das Protokoll kann für die Untersuchung des hochdynamischen Prozesses der Chlorophylsynthese nützlich sein, der von einer Reihe von Faktoren beeinflusst wird, sowohl exogen (Salz, Dürre, Biostimulanzien, Schwermetalle usw.) als auch endogen (typischerweise verbunden mit Veränderungen in der Genaktivität) im Ursprung, ohne dass Pflanzengewebe abgelöst werden muss, wodurch zusätzlicher Stress vermieden wird.
Kritische Schritte des Protokolls und Fehlerbehebung – kein Licht und kümmern Sie sich um die Maske
Wie direkt in der obigen Protokollbeschreibung hervorgehoben, ist es von entscheidender Bedeutung, selbst Spuren von Licht sowohl während der Kultivierung von etiolierten Pflanzensämlingen als auch kurz vor Beginn des Protokolls zu vermeiden11. In unserem Aufbau verwenden wir eine spezielle dunkle Kammer, die sich im begehbaren Phytotron befindet und durch eine lichtdichte Dre…
The authors have nothing to disclose.
Diese Arbeit wurde durch das Europäische Fonds für regionale Entwicklung-Projekt SINGING PLANT (Nr. CZ.02.1.01/0.0/0.0/16_026/0008446). Dieses Projekt wurde durch das Projekt MSCA4Ukraine (ID 1233580) gefördert, das von der Europäischen Union finanziert wird. Wir danken Lenka Sochurkova für die grafische Gestaltung von Abbildung 1.
6-benzylaminopurine | Duchefa Biochemie | B0904.0001 | |
Aluminum foil | Merck | Z691577 | |
Arabidopsis thaliana Col-0 seeds | NASC collection | N1092 | |
Cultivation chamber | PSI | custom made | |
Dimethilsulfoxid | Thermo Fisher Scientific | 042780.AK | |
Eppendorf single-channeled, variable (100-1000 μL) | Merck | EP3123000063 | |
Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101 | |
iReenCAM device | PSI | custom made/prototype | |
Laboratory bottles, with caps (Duran), 100mL | Merck | Z305170-10EA | |
Laminar-flow box | UniGreenScheme | ITEM-31156 | |
Linerless Rubber Splicing Tape, 19 mm width, black, Scotch | 3M Science. Applied to Life | 7000006085 | |
Microcentrifuge tube, 2 mL with lid, PPT, BRAND | Merck | BR780546-500EA | |
Micropore tape | 3M Science. Applied to Life | 7100225115 | |
Osram lumilux green l18w/66 | Ovalamp | 200008833 | |
Petri plates – Greiner dishes, square, 120 x 120 x17mm, vented | Merck | Z617679-240EA | |
Pipet tips, 1000 μL, Axygen | Merck | AXYT1000B | |
The Plant Screen Data Analyzer software | PSI | delivered as a part of the iReenCAM |