Summary

Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro(체외 말초 신경 재생을 위한 나노초 펄스 전기장에 의한 Schwann 세포 성장 조절)

Published: May 03, 2024
doi:

Summary

여기에서는 시험관 내에서 Schwann 세포를 자극하기 위해 나노초 펄스 전기장(nsPEF)을 적용하는 프로토콜을 제시합니다. 관련 인자의 합성 및 분비 능력과 세포 거동 변화는 nsPEF를 사용하여 성공적인 자극을 검증했습니다. 이 연구는 말초 신경 재생 방법에 대한 긍정적인 견해를 제공합니다.

Abstract

슈반세포(Schwann cell, SC)는 말초 신경계의 수초화 세포로, 말초 신경 재생에 중요한 역할을 합니다. 나노초 펄스 전기장(nsPEF)은 세포 증식 및 기타 생물학적 과정을 자극하는 데 효과적인 것으로 입증된 신경 전기 자극에 적용할 수 있는 새로운 방법입니다. SC가 nsPEF 하에서 상당한 변화를 겪는지 여부를 평가하고 새로운 말초 신경 재생 방법의 가능성을 탐색하는 데 도움이 되도록 배양된 RSC96 세포를 5kV 및 10kV에서 nsPEF 자극을 받은 후 3-4일 동안 계속 배양했습니다. 그 후, SC에 의해 발현된 일부 관련 인자를 평가하여 특정 마커 단백질, 신경 영양 인자, 전사 인자 및 수초화 조절자를 포함하여 성공적인 자극을 입증했습니다. 대표적인 결과에서, nsPEF는 SC의 증식과 이동을 유의하게 향상시키고, 말초신경의 재생에 긍정적으로 기여하는 관련 인자를 종합하는 능력을 향상시킨다는 것을 보여주었다. 동시에, GFAP의 낮은 발현은 말초 신경 손상의 양성 예후를 나타냈다. 이러한 모든 결과는 nsPEF가 SC를 자극함으로써 말초 신경 손상에 대한 효율적인 치료 방법으로서 큰 잠재력을 가지고 있음을 보여줍니다.

Introduction

매년 수백만 명의 사람들이 말초 신경계(PNS)와 중추 신경계(CNS)와 관련된 신경 손상의 영향을 받습니다1. 연구에 따르면 신경 손상 후 중추신경계의 축삭 복구 능력은 상당히 제한되는 반면, PNS는 SC의 상당한 가소성으로 인해 향상된 용량을 보여줍니다2. 그럼에도 불구하고 말초 신경 손상 후 완전한 재생을 달성하는 것은 여전히 힘든 일이며 인간의 건강에 심각한 도전을 제기하고 있습니다 3,4. 오늘날, 자가이식편은 기증자 부위 이환율과 제한된 가용성이라는 단점에도 불구하고 일반적인 치료법으로 남아 있다5. 이러한 상황으로 인해 연구자들은 재료6, 분자 요인7 및 전기 자극(ES)을 포함한 대체 요법을 모색하게 되었습니다. 축삭돌기의 성장과신경 재생을 촉진하는 요인8 때문에, 적절한 ES 방법을 선택하고 ES와 SC 사이의 관계를 탐색하는 것이 필수적이다.

SC는 PNS의 주요 신경교세포로서 PNS 9,10의 재생에 중요한 역할을 합니다. 말초신경 손상 후, SC는 신경의 재생을 수행하기 위해 빠른 활성화, 광범위한 재프로그래밍2, 미엘린 형성 상태에서 성장 지원 형태로의 전환을 거친다2. SCs의 실질적 증식은 손상된 신경의 원위부 말단에서 발생하는 반면, 원위 그루터기의 SC는 증식과 신장을 거쳐 Bungner’s band를 형성하는데, 이는 축삭이 표적 기관11을 향해 성장하도록 안내하는 데 필요합니다. 더욱이, 근위 및 원위 신경 그루터기에서 나온 SC는 신경 다리로 이동하여 SC 탯줄을 형성하여 축삭 재생을 촉진한다12. 또한, 선행 연구에서는 말초신경 재생의 경우 전사 인자(transcriptional factor)13, 신경영양 인자(neurotrophic factor)14 및 수초화 조절인자(myelination regulator)13를 포함하여 SC와 관련된 관련 인자의 합성 및 분비가 변화한다는 것을 입증했다. 이는 또한 SC의 활성을 평가하기 위한 지표를 제공한다. 이를 바탕으로 SC의 증식, 이동, 합성 및 관련 인자의 분비 촉진이 말초신경 재생을 개선하기 위해 광범위하게 연구되었다15.

이전 연구에서는 신경 재생에 ES를 사용할 수 있는 가능성을 입증했습니다1. 널리 받아들여지는 설명은 ES가 세포막의 탈분극을 유도하고, 막 전위를 변경하며, 이러한 생체 분자의 전하 분포를 변화시킴으로써 막 단백질 기능에 영향을 미칠 수 있다는 것입니다1. 그러나 Intense PEF를 널리 적용하면 심한 통증, 불수의적 근육 수축 및 심장 세동을 유발할 수 있다8. 또한 크레아틴 키나아제(CK) 활성을 증가시키고, 근력을 감소시키며, 지연성 발병 근육통(DOMS)의 발병을 유도합니다16. nsPEF는 나노초 펄스 지속 시간 내에 고전압 전기장으로 피험자를 자극하는 새로운 기술이며, 세포 수준 연구에서 점차 사용되고 있습니다17,18. 이전 연구에서는 세포 증식 및 세포 소기관 활동을 촉진하는 nsPEF의 가능한 근거는 막 나노 기공의 형성과 이온 채널의 활성화이며, 이는 세포질 Ca2+ 농도의 증가로 이어진다고 보고했습니다19. nsPEF는 펄스 전력 기술을 활용하여 세포막을 충전하여 짧은 지속 시간, 빠른 상승 시간, 높은 전력 및 낮은 에너지 밀도를 특징으로 하는 펄스를 생성합니다20. 이러한 특성은 nsPEF가 자극 부작용이 최소화된 바람직한 모드일 수 있음을 시사한다8. 또한 nsPEF는 외과적 중재에 비해 최소 침습 시술, 가역성, 조정 가능성 및 신경 조직에 대한 비파괴성과 같은 이점을 제공합니다. 생물 의학 분야에서 nsPEF의 주류 연구 방향 중 하나는 고에너지 전기장 자극을 이용한 종양 조직 절제에 대한 응용 분야입니다 21,22,23. 일부 연구 결과에 따르면 12-nsPEF는 손상을 일으키지 않고 말초 신경을 자극할 수 있습니다24. 그러나 현재로서는 신경 재생 분야에서 nsPEF의 적용에 관한 증거는 제한적입니다. 또한, nsPEF를 사용하여 SC를 자극하는 것은 선구적인 시도로, 추가적인 in vivo 및 임상 연구에 기여합니다. 본 연구는 SC의 nsPEF 자극이 신경 재생을 촉진할 수 있는지, 그리고 이후의 심층적이고 체계적인 연구를 위한 신뢰할 수 있는 근거를 제공할 수 있는지를 탐구한다.

Protocol

1. 동결 보존된 RSC96 세포의 해동 1mL의 세포 현탁액이 들어있는 cryovial을 37°C 수조에서 빠르게 흔들어 해동한 다음 4-6mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 원심분리 튜브에 넣고 잘 섞습니다. 1000 x g 에서 3-5분 동안 원심분리하고 상층액을 버리고 세포를 3mL의 완전한 배양 배지에 재현탁시킵니다. 세포 현탁액을 6-8mL의 완전 배양 배지가 들어 있는 배양 플라스?…

Representative Results

저강도 펄스 전기장은 세포 증식을 자극합니다.CCK-8 분석에 따르면, 5kV/cm 그룹에서 RSC96의 증식 속도는 대조군 세포보다 유의하게 빨랐다. 그러나 매개변수가 증가함에 따라(20kV/cm 및 40kV/cm) 증식 속도는 불안정했으며 대조군보다 더 낮았습니다. 40kV/cm군에서 RSC96 세포의 세포 증식률은 대조군 및 5kV/cm군에 비해 유의하게 낮았으며, 통계적으로 유의한 차이를 보였다(P < 0.05). 세포 증?…

Discussion

최근 몇 년 동안 nsPEF의 응용 프로그램은 보고된 바와 같이 급격한 성장을 경험했습니다. nsPEF는 원하는 부위에만 고도로 표적화된 효과를 가지며, 추가적인 열적 손상을 일으키지 않고 치료하기에 충분한 에너지를 제공하여 인체에 더 안전하다28. 이러한 특성은 종양 치료 및 신경 재생에서 유망한 번역 전망을 제공합니다. 그러나 일부 연구에서는 nsPEF의 몇 가지 한계를 제안했?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

이 연구는 국가 핵심 과학 기기 및 장비 개발 프로젝트(NO.82027803)의 자금 지원을 받았습니다.

Materials

Antifade mounting medium Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1401
Anti-GFAP Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB12100-100
Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB12144-100
Anti-S100 beta Mouse mAb Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB14146-100
BSA Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GC305010
Coverslip Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD 10212432C
CY3-labeled goat anti-mouse IgG Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD GB21302
DAPI Staining Reagent Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1012
Decolorizing shaker Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD DS-2S100
High Voltage Power Supply for nsPEF Matsusada Precision Inc. AU-60P1.6-L
Histochemical pen Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G6100
Membrane breaking liquid Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G1204
Microscope slide Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G6012
Palm centrifuge Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD MS6000
PBS powdered Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD G0002
Pipette Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD
Positive fluorescence microscope Nikon, Japan NIKON ECLIPSE C1
Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD BS-20563R-AF488
RSC96 Schwann cells Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD STCC30007G-1
scanister 3DHISTECH Pannoramic MIDI
Special cable for nsPEF Times Microwave Systems M17/78-RG217
Turbine mixer Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD MV-100

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Han, J., Wang, Z., Dong, Y., Zou, X., Wang, H., Chen, Y., Abdalbary, S. A., Tu, T., Lu, H. Regulating Schwann Cell Growth by Nanosecond Pulsed Electric Field for Peripheral Nerve Regeneration In Vitro. J. Vis. Exp. (207), e66097, doi:10.3791/66097 (2024).

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