Regulering av Schwann-cellevekst ved nanosekund pulserende elektrisk felt for perifer nerveregenerering in vitro
Summary
Her presenterer vi en protokoll for påføring av nanosekund pulselektrisk felt (nsPEF) for å stimulere Schwann-celler in vitro. Syntese- og sekresjonsevnen til relevante faktorer og celleatferdsendringer validerte den vellykkede stimuleringen ved bruk av nsPEF. Studien gir et positivt syn på den perifere nerveregenereringsmetoden.
Abstract
Schwann-celler (SC) er myeliniserende celler i det perifere nervesystemet, som spiller en avgjørende rolle i perifer nerveregenerering. Nanosecond Pulse Electric Field (nsPEF) er en ny metode som kan brukes i nerveelektrisk stimulering som har vist seg å være effektiv for å stimulere celleproliferasjon og andre biologiske prosesser. Med sikte på å vurdere om SC-er gjennomgår betydelige endringer under nsPEF og bidra til å utforske potensialet for nye perifere nerveregenereringsmetoder, ble dyrkede RSC96-celler utsatt for nsPEF-stimulering ved 5 kV og 10 kV, etterfulgt av fortsatt dyrking i 3-4 dager. Deretter ble noen relevante faktorer uttrykt av SC-er vurdert for å demonstrere vellykket stimulering, inkludert det spesifikke markørproteinet, nevrotrofisk faktor, transkripsjonsfaktor og myeliniseringsregulator. De representative resultatene viste at nsPEF signifikant forbedret spredning og migrasjon av SC-er og evnen til å syntetisere relevante faktorer som bidrar positivt til regenerering av perifere nerver. Samtidig indikerte lavere ekspresjon av GFAP den godartede prognosen for perifere nerveskader. Alle disse resultatene viser at nsPEF har et stort potensial som en effektiv behandlingsmetode for perifere nerveskader ved å stimulere SC.
Introduction
Hvert år rammes millioner av mennesker av nerveskader som involverer både det perifere nervesystemet (PNS) og sentralnervesystemet (CNS)1. Studier har vist at den aksonale reparasjonskapasiteten til CNS er ganske begrenset etter nerveskader, mens PNS viser økt kapasitet på grunn av den betydelige plastisiteten til SC2. Likevel er det fortsatt vanskelig å oppnå fullstendig regenerering etter perifere nerveskader og fortsetter å utgjøre en betydelig utfordring for menneskers helse 3,4. I dag har autotransplantater forblitt en vanlig behandling til tross for ulempene med sykelighet på donorstedet og begrenset tilgjengelighet5. Denne situasjonen har fått forskere til å utforske alternative terapier, inkludert materialer6, molekylære faktorer7 og elektrisk stimulering (ES). Som en faktor som fremmer aksonal vekst og nerveregenerering8, blir det viktig å velge en passende metode for ES og utforske forholdet mellom ES og SC.
SC-er er de viktigste gliacellene i PNS, og spiller en avgjørende rolle i regenereringen av PNS 9,10. Etter perifere nerveskader gjennomgår SC-er rask aktivering, omfattende omprogrammering2 og overgang fra en myelindannende tilstand til en vekststøttende morfologi for å utføre regenerering av nerven2. En betydelig spredning av SC-er skjer i den distale enden av den skadede nerven, mens SC-er i den distale stubben gjennomgår proliferasjon og forlengelse for å danne Bungners bånd, som er nødvendige for å lede aksoner til å vokse mot målorganet11. Videre migrerer SC-er fra de proksimale og distale nervestumpene inn i nervebroen for å danne SC-snorer som fremmer aksonregenerering12. Videre har tidligere studier vist at syntese og sekresjon av relevante faktorer relatert til SC-er endres i tilfeller av perifer nerveregenerering, inkludert transkripsjonsfaktorer13, nevrotrofiske faktorer14 og myeliniseringsregulatorer13. Dette gir også indikatorer for å vurdere aktiviteten til SCs. Basert på disse har fremme av SC-proliferasjon, migrasjon, syntese og sekresjon av relevante faktorer blitt grundig undersøkt for å forbedre perifer nerveregenerering15.
Tidligere studier har vist muligheten for å bruke ES for nerveregenerering1. En allment akseptert forklaring er at ES kan indusere depolarisering av cellemembraner, endre membranpotensial og påvirke membranproteinfunksjoner ved å endre ladningsfordelingene på disse biomolekylene1. Imidlertid kan mye brukt intens PEF forårsake sterke smerter, ufrivillige muskelsammentrekninger og hjerteflimmer8. Det øker også kreatinkinaseaktiviteten (CK), reduserer muskelstyrken og induserer utviklingen av forsinket muskelsårhet (DOMS)16. nsPEF er en ny teknikk som stimulerer testpersoner med høyspente elektriske felt innenfor en nanosekunds pulsvarighet, og den blir gradvis brukt i forskning på mobilnivå17,18. Tidligere studier har rapportert at den mulige begrunnelsen for at nsPEF fremmer celleproliferasjon og organellaktivitet er dannelsen av membrannanoporer og aktivering av ioniske kanaler, noe som fører til en økning i cytoplasmatisk Ca2+-konsentrasjon19. nsPEF bruker pulskraftteknologi for å lade cellemembranen, og produserer pulser preget av kort varighet, rask stigetid, høy effekt og lav energitetthet20. Disse egenskapene antyder at nsPEF kan være en foretrukket modus med minimale stimuleringsbivirkninger8. Videre tilbyr nsPEF fordeler som minimalt invasive prosedyrer, reversibilitet, justerbarhet og ikke-destruktivitet for nevralt vev sammenlignet med kirurgiske inngrep. En vanlig forskningsretning for nsPEF i det biomedisinske feltet er dens anvendelse for tumorvevsablasjon ved bruk av høyenergi elektrisk feltstimulering 21,22,23. Noen forskningsresultater tyder på at 12-nsPEF kan stimulere perifere nerver uten å forårsake skade24. For tiden er det imidlertid begrenset bevis for bruk av nsPEF innen nerveregenerering. Videre er stimulering av SC-er ved bruk av nsPEF et banebrytende forsøk, som bidrar til videre in vivo og klinisk forskning. Denne studien undersøker om nsPEF-stimulering av SC-er kan fremme nerveregenerering og gi et pålitelig grunnlag for påfølgende dyptgående og systematisk forskning.
Protocol
Representative Results
Discussion
De siste årene har bruken av nsPEF opplevd økt vekst, som rapportert. nsPEF har en svært målrettet effekt på bare det ønskede området, og gir nok energi til å behandle uten å forårsake ytterligere termisk skade, noe som gjør det tryggere for menneskekroppen28. Disse egenskapene gir den lovende translasjonsutsikter innen tumorbehandling og nerveregenerering. Noen studier har imidlertid foreslått noen begrensninger for nsPEF. Sammenlignet med materialforskning er ES begrenset av eksterne…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble finansiert av National Key Scientific Instrument and Equipment Development Project (NO.82027803).
Materials
| Antifade mounting medium | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | G1401 | |
| Anti-GFAP Mouse mAb | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | GB12100-100 | |
| Anti-Neurofilament heavy polypeptide Mouse mAb | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | GB12144-100 | |
| Anti-S100 beta Mouse mAb | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | GB14146-100 | |
| BSA | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | GC305010 | |
| Coverslip | Jiangsu Shitai experimental equipment Co., LTD | 10212432C | |
| CY3-labeled goat anti-mouse IgG | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | GB21302 | |
| DAPI Staining Reagent | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | G1012 | |
| Decolorizing shaker | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | DS-2S100 | |
| High Voltage Power Supply for nsPEF | Matsusada Precision Inc. | AU-60P1.6-L | |
| Histochemical pen | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | G6100 | |
| Membrane breaking liquid | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | G1204 | |
| Microscope slide | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | G6012 | |
| Palm centrifuge | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | MS6000 | |
| PBS powdered | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | G0002 | |
| Pipette | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | ||
| Positive fluorescence microscope | Nikon, Japan | NIKON ECLIPSE C1 | |
| Rabbit Anti-SOX10/AF488 Conjugated antibody | Beijing Bioss Biotechnology Co., LTD | BS-20563R-AF488 | |
| RSC96 Schwann cells | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | STCC30007G-1 | |
| scanister | 3DHISTECH | Pannoramic MIDI | |
| Special cable for nsPEF | Times Microwave Systems | M17/78-RG217 | |
| Turbine mixer | Wuhan Xavier Biotechnology Co., LTD | MV-100 |
References
- Jing, W., et al. Study of electrical stimulation with different electric-field intensities in the regulation of the differentiation of PC12 cells. ACS Chem Neurosci. 10 (1), 348-357 (2018).
- Nocera, G., Jacob, C. Mechanisms of Schwann cell plasticity involved in peripheral nerve repair after injury. Cell Mol Life Sci. 77, 3977-3989 (2020).
- Aguilar, Z. . Nanomaterials for Medical Applications. , (2012).
- Xie, S., et al. Efficient generation of functional Schwann cells from adipose-derived stem cells in defined conditions. Cell Cycle. 16 (9), 841-851 (2017).
- Rosenbalm, T. N., Levi, N. H., Morykwas, M. J., Wagner, W. D. Electrical stimulation via repeated biphasic conducting materials for peripheral nerve regeneration. J Mater Sci Mater Med. 34 (11), 1-18 (2023).
- Daly, W. T., et al. Comparison and characterization of multiple biomaterial conduits for peripheral nerve repair. Biomaterials. 34 (34), 8630-8639 (2013).
- Lee, B. -. K., et al. End-to-side neurorrhaphy using an electrospun PCL/collagen nerve conduit for complex peripheral motor nerve regeneration. Biomaterials. 33 (35), 9027-9036 (2012).
- Kim, V., Gudvangen, E., Kondratiev, O., Redondo, L., Xiao, S., Pakhomov, A. G. Peculiarities of neurostimulation by intense nanosecond pulsed electric fields: how to avoid firing in peripheral nerve fibers. Int J Mol Sci. 22 (13), 7051 (2021).
- Assinck, P., Duncan, G. J., Hilton, B. J., Plemel, J. R., Tetzlaff, W. Cell transplantation therapy for spinal cord injury. Nat Neurosci. 20 (5), 637-647 (2017).
- Chen, Y. Y., McDonald, D., Cheng, C., Magnowski, B., Durand, J., Zochodne, D. W. Axon and Schwann cell partnership during nerve regrowth. J Neuropathol Exp Neurol. 64 (7), 613-622 (2005).
- Yi, S., et al. Tau modulates Schwann cell proliferation, migration and differentiation following peripheral nerve injury. J Cell Sci. 132 (6), (2019).
- Min, Q., Parkinson, D. B., Dun, X. Migrating Schwann cells direct axon regeneration within the peripheral nerve bridge. Glia. 69 (2), 235-254 (2021).
- Zhang, Y., Zhao, Q., Chen, Q., Xu, L., Yi, S. Transcriptional control of peripheral nerve regeneration. Mol Neurobiol. 60 (1), 329-341 (2023).
- Nishi, M., Kawata, M., Azmitia, E. C. Trophic interactions between brain-derived neurotrophic factor and S100β on cultured serotonergic neurons. Brain Res. 868 (1), 113-118 (2000).
- Gu, Y., et al. miR-sc8 inhibits Schwann cell proliferation and migration by targeting EGFR. PLoS One. 10 (12), e0145185 (2015).
- Dong, H. -. L., et al. AMPK regulates mitochondrial oxidative stress in C2C12 myotubes induced by electrical stimulations of different intensities. Nan Fang Yi Ke Da Xue Xue Bao. 38 (6), 742-747 (2018).
- Beebe, S. J., Blackmore, P. F., White, J., Joshi, R. P., Schoenbach, K. H. Nanosecond pulsed electric fields modulate cell function through intracellular signal transduction mechanisms. Physiol Meas. 25 (4), 1077 (2004).
- Haberkorn, I., Siegenthaler, L., Buchmann, L., Neutsch, L., Mathys, A. Enhancing single-cell bioconversion efficiency by harnessing nanosecond pulsed electric field processing. Biotechnol Adv. 53, 107780 (2021).
- Ruiz-Fernández, A. R., Campos, L., Gutierrez-Maldonado, S. E., Núñez, G., Villanelo, F., Perez-Acle, T. Nanosecond pulsed electric field (nsPEF): Opening the biotechnological Pandora’s box. Int J Mol Sci. 23 (11), 6158 (2022).
- Nuccitelli, R., et al. First-in-human trial of nanoelectroablation therapy for basal cell carcinoma: proof of method. Exp Dermatol. 23 (2), 135-137 (2014).
- Nuccitelli, R., et al. Non-thermal nanoelectroablation of UV-induced murine melanomas stimulates an immune response. Pigment Cell Melanoma Res. 25 (5), 618-629 (2012).
- Carr, L., et al. A nanosecond pulsed electric field (nsPEF) can affect membrane permeabilization and cellular viability in a 3D spheroids tumor model. Bioelectrochemistry. 141, 107839 (2021).
- Hornef, J., Edelblute, C. M., Schoenbach, K. H., Heller, R., Guo, S., Jiang, C. Thermal analysis of infrared irradiation-assisted nanosecond-pulsed tumor ablation. Sci Rep. 10 (1), 5122 (2020).
- Zuo, K. J., Gordon, T., Chan, K. M., Borschel, G. H. Electrical stimulation to enhance peripheral nerve regeneration: Update in molecular investigations and clinical translation. Exp Neurol. 332, 113397 (2020).
- Juckett, L., Saffari, T. M., Ormseth, B., Senger, J. -. L., Moore, A. M. The effect of electrical stimulation on nerve regeneration following peripheral nerve injury. Biomolecules. 12 (12), 1856 (2022).
- Jessen, K. R., Mirsky, R. Negative regulation of myelination: relevance for development, injury, and demyelinating disease. Glia. 56 (14), 1552-1565 (2008).
- Chen, Z. -. L., Yu, W. -. M., Strickland, S. Peripheral regeneration. Annu Rev Neurosci. 30, 209-233 (2007).
- Yin, D., et al. Cutaneous papilloma and squamous cell carcinoma therapy utilizing nanosecond pulsed electric fields (nsPEF). PloS One. 7 (8), e43891 (2012).
- Qi, F., et al. Photoexcited wireless electrical stimulation elevates nerve cell growth. Colloids Surf B Biointerfaces. 220, 112890 (2022).
- Mi, Y., Liu, Q., Li, P., Xu, J., Yang, Q., Tang, J. Targeted gold nanorods combined with low-intensity nsPEFs enhance antimelanoma efficacy in vitro. Nanotechnology. 31 (35), 355102 (2020).
- Ho, T. -. C., et al. Hydrogels: Properties and applications in biomedicine. Molecules. 27 (9), 2902 (2022).
