Summary

Obtenção de criosecções de alta qualidade de olho de coelho inteiro

Published: November 10, 2023
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Summary

Este protocolo descreve um método confiável para obter criosseções de alta qualidade de olhos inteiros de coelho. Ele detalha os procedimentos de dissecção, fixação, incorporação e seccionamento do olho do coelho, que podem ser facilmente adaptados para uso em qualquer estudo que utilize imuno-histoquímica em olhos maiores.

Abstract

Este protocolo descreve como obter criossecções retinianas de alta qualidade em animais maiores, como coelhos. Após a enucleação, o olho é brevemente imerso no fixador. Em seguida, a córnea e a íris são removidas e o olho é deixado durante a noite para fixação adicional a 4 °C. Após a fixação, a lente é removida. O olho é então colocado em um criomold e preenchido com um meio de inclusão. Ao remover a lente, o meio de incorporação tem melhor acesso ao vítreo e leva a uma melhor estabilidade da retina. É importante ressaltar que o olho deve ser incubado em meio de incorporação durante a noite para permitir a infiltração completa em todo o vítreo. Após a incubação durante a noite, o olho é congelado em gelo seco e seccionado. Cortes retinianos inteiros podem ser obtidos para uso em imuno-histoquímica. Protocolos de coloração padrão podem ser utilizados para estudar a localização de antígenos no tecido retiniano. A adesão a este protocolo resulta em criossecções retinianas de alta qualidade que podem ser usadas em qualquer experimento que utilize imuno-histoquímica.

Introduction

A retina é composta por várias camadas de células especializadas dentro do olho que, juntas, trabalham para converter a luz em sinais neurais. Como a retina desempenha um papel crítico na visão, entender sua estrutura e função pode fornecer informações valiosas sobre algumas das causas mais comuns de perda de visão, como degeneração macular e retinopatia diabética, entre outras.

Os coelhos servem como um modelo animal conveniente na pesquisa da retina, pois oferecem várias vantagens em comparação com outros modelos. Os olhos de coelho são relativamente semelhantes em anatomia aos olhos humanos 1,2. Por exemplo, os coelhos têm uma área de densidade aumentada de fotorreceptores, conhecida como faixa visual horizontal, que é análoga à fóvea em humanos. Outros modelos animais comumente usados, como roedores, não têm um equivalente anatômico. Além disso, em comparação com os roedores, a vasculatura da retina em coelhos é bastante semelhante à dos humanos. Os olhos do coelho também são relativamente grandes. Isso os torna particularmente adequados para estudos que envolvem administração de medicamentos ou intervenção cirúrgica no vítreo ou na retina que, de outra forma, poderiam ser difíceis ou impossíveis em um olho menor3.

A imuno-histoquímica (IHQ) é uma técnica amplamente utilizada para estudar a localização de antígenos dentro de um tecido e tem amplas aplicações na pesquisa da retina 4,5,6. Como a retina é uma estrutura delicada, a obtenção de resultados úteis via IHC requer um processamento cuidadoso do tecido. O descolamento de retina e outros artefatos teciduais, como quebras ou dobras da retina, geralmente ocorrem durante o processamento e podem interferir na interpretação dos resultados. O processamento bem-sucedido depende de uma variedade de fatores, incluindo manipulação do tecido, tipo e duração da fixação, tipo de meio de incorporação e técnicas de seccionamento 7,8,9,10. Apesar das vantagens de usar coelhos como modelo animal na pesquisa da retina, existem muito poucos protocolos que descrevem o processamento bem-sucedido do tecido da retina do coelho. Este artigo descreve um método confiável para obter seções retinianas de alta qualidade de olhos inteiros de coelho para uso em IHQ.

Protocol

Todos os procedimentos foram realizados em conformidade e aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais (IACUC) da Universidade do Sul da Califórnia. Quatorze (n = 14) coelhos com cinto holandês entre 4 e 6 meses de idade foram utilizados no desenvolvimento deste protocolo. Foram utilizados animais machos e fêmeas. Todos os animais pesavam entre 2,0 e 2,5 kg. Todos os animais foram alojados individualmente. Uma lista de materiais e equipamentos recomendados pode ser encontrada na Tabela de …

Representative Results

Após o processamento do tecido, um protocolo de imunofluorescência padrão pode ser utilizado para investigar qualquer número de processos biológicos dentro da retina. A Figura 3A-C ilustra imagens de fluorescência representativas de uma seção da retina obtidas por microscopia confocal. A secção retiniana foi imunomarcada de acordo com um protocolo previamentedescrito12. As seções retinianas repr…

Discussion

Antes de implementar o protocolo acima, enfrentamos consistentemente dificuldades com o processamento tecidual de olhos de coelho para IHQ. Adaptamos vários protocolos dos olhos de animais menores, como camundongos, mas descobrimos que eles levavam a uma fixação inadequada e dificuldade de seccionamento do tecido. Existem várias considerações importantes que permitem seções consistentes e de alta qualidade da retina do coelho.

Uma consideração é o grande tamanho do globo do coelho e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Obrigado a Rosanna Calderon, Dominic Shayler e Rosa Sierra pelo aconselhamento técnico. Este estudo foi apoiado em parte por uma doação irrestrita ao Departamento de Oftalmologia da USC Keck School of Medicine de Pesquisa para Prevenir a Cegueira (AN), NIH K08EY030924 (AN), Las Madrinas Endowment in Experimental Therapeutics for Ophthalmology (AN), um Prêmio de Desenvolvimento de Carreira de Pesquisa para Prevenir a Cegueira (AN), Knights Templar Eye Foundation Endowment (AN), e a Fundação Memorial Edward N. e Della L. Thome (AN, KG).

Materials

100 mm culture dish Corning 353025 Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
50 mL tube Genesee Scientific 28-106 For fixation and cryoprotection (step 1)
Cryostat Leica CM1850 For cryosectioning (step 7)
Curved scissors Fine Science Tools 91500-09 Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
DAPI Fisher Scientific D3571 Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Dissection microscope Zeiss Stemi 2000-C Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Donkey anti-Goat 488 Fisher Scientific A-11055 Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Donkey anti-Mouse 555 Fisher Scientific A-31570 Diluted 1:1,000 in blocking buffer
Forceps Fine Science Tools 91150-20 Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Glass Slide Cover VWR 48404-453 For cryosectioning (step 7)
Goat anti-SOX2 R&D Systems AF2018 Diluted 1:100 in blocking buffer
High-profile disposable cryostat blades Leica Microsystems Inc. 14035838926 For cryosectioning (step 7)
Kimwipe Fisher Scientific 06-666-A Used to wipe away excess PBS or OCT (steps 3 and 6)
Mouse anti-RPE65 Novus Bio NB100-355SS Diluted 1:100 in blocking buffer
OmniPur Sucrose Millipore 167117 Used for cryoprotectant (step 1.2)
Paraformaldehyde 20% solution Electron Microscopy Sciences 15713 Used as tissue fixative (diluted to 4% in step 1.1)
Peel-A-Away Disposable Embedding Mold (22x22x20 mm Deep) Polysciences, Inc. 18646A Used as embedding mold (step 6)
Phosphate buffered saline, 1x Corning 21-030-CV Used in preparation of fixative (step 1.1) and cryoprotectant (step 1.2)
Scalpel blade no. 15 Feather 08-916-5D Used for dissection (steps 1.3, 3, and 5)
Superfrost Plus Microscope Slides Fisher Scientific 12-550-15 For cryosectioning (step 7)
Tissue-Tek O.C.T. Compound Sakura 4583 Used as embedding media (step 6)

References

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Cite This Article
Souverein, E. A., Nagiel, A., Gnedeva, K. Obtaining High-Quality Cryosections of Whole Rabbit Eye . J. Vis. Exp. (201), e66115, doi:10.3791/66115 (2023).

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