산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병/당뇨병성 망막병증 관련 모욕으로 인한 사망에 대한 망막 혈관의 복원력을 모니터링하기 위해 보호 분석법이 개발되었습니다.
당뇨병성 망막증(DR)은 발병기전에서 두 가지 뚜렷한 단계를 특징으로 하는 복잡하고 진행성 안구 질환입니다. 첫 번째 단계는 당뇨병으로 인한 망막 손상에 대한 보호 기능 상실을 수반하는 반면, 두 번째 단계는 이러한 손상의 축적에 중점을 둡니다. 기존 분석법은 주로 손상의 심각성을 나타내는 모세관 변성을 평가하는 데 중점을 두며, 기본적으로 DR의 두 번째 단계를 다룹니다. 그러나 망막 혈관의 보호 메커니즘이 손상되었는지 여부에 대한 통찰력을 간접적으로 제공할 뿐입니다. 이러한 한계를 극복하기 위해 망막의 보호 메커니즘, 특히 산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 당뇨병으로 인한 모욕에 대한 망막의 회복력을 직접 평가하는 새로운 접근법이 개발되었습니다. 이 보호 분석법은 처음에는 당뇨병성 망막병증을 위해 설계되었지만 생리학적 및 병리학적 맥락 모두에서 더 광범위하게 적용할 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 요약하면, 당뇨병성 망막병증의 발병기전을 이해하려면 보호 손실과 손상 누적의 이중 단계를 인식해야 하며, 이 혁신적인 보호 분석법은 연구에 유용한 도구를 제공하고 잠재적으로 다른 의학적 상태로 확장될 수 있습니다.
당뇨병성 망막병증(DR)은 진성 당뇨병(DM)의 미세혈관 합병증 중 하나이며, 선진국의 노동 연령 실명의 주요 원인입니다1. 당뇨병성 망막병증의 주요 위험인자는 고혈당증의 기간과 정도이다 2,3,4. DM은망막의 혈관 및 신경 구성 요소 모두의 기능 장애를 유발하지만5 DR의 진단은 망막 혈관 구조6의 형태학적 특징에 기초한다.
고혈당으로 인한 산화 스트레스는 DR 발병의 원인 중 하나이다7. 산화 스트레스가 증가하면 광범위한 손상이 발생하여 미토콘드리아의 기능이 손상되어 활성 산소 종의 수준이 더욱 높아집니다. 이러한 현상은 망막 혈관의 누출, 염증성 사이토카인 수치의 증가, 망막 내 신경 및 혈관 세포 유형의 사멸을 동반합니다. 혈관 세포의 손실과 그에 따른 망막의 광범위한 모세혈관 네트워크의 기능은 다양한 반응을 위한 강력한 자극인 저산소증을 초래한다5. 이러한 반응에는 투과성과 혈관신생을 모두 유발하는 혈관내피성장인자(VEGF)의 발현 증가, 당뇨병성 황반부종과 증식성 당뇨병성 망막병증의 진행된 시력 위협 단계의 주요 특징이 포함된다6.
DR의 특정 특징은 유기체(환자 및 실험 동물 모두)가 이 적응증에 저항할 수 있는 내재적 능력을 가지고 있음을 시사합니다. 환자는 시력을 위협하는 DR 8,9,10,11,12,13이 발생하기 전에 수십 년의 DM을 경험합니다. DM의 설치류 모델은 DR14의 진행된 시력 위협 단계를 발달시키지 않는 반면, 나타나는 DR의 초기/경미한 형태는 DM15,16의 몇 주 또는 몇 달 후에만 발현된다. 또한, 환자와 실험동물 모두에서 DR은 진행성이며, DM의 지속 기간이 길어질수록 망막 기능 장애/손상이 증가합니다. 마지막으로, DM을 앓고 있는 일부 환자들은 DR이 전혀 발생하지 않습니다. 어떤 경우에는 이러한 개인이 DR이 발생할 만큼 충분히 오래 당뇨병을 경험하지 않기 때문입니다. 다른 경우에는 DR에 대한 특별한 저항을 나타내기 때문입니다. DM17을 50년 이상 복용한 후에도 DR이 발생하지 않는 Medalist 연구 참가자의 경우와 같습니다. DR로부터의 보호의 존재와 엄청난 번역 관련성에 대한 강력한 지원에도 불구하고 보호의 기본 메커니즘은 적극적으로 조사되지 않았습니다.
본원에 기술된 보호 분석법은 당뇨병성 마우스에서 DR이 DM의 시작으로부터 지연되는 이유에 대한 조사를 용이하게 하기 위해 개발되었다. DM 및 non-DM 마우스에 적용되는 이 분석의 주요 단계에는 (1) 눈에 최대 이하의 사망 유도 모욕을 전달(생체 외 또는 생체 내), (2) 망막 혈관 분리, (3) TUNEL 및 DAPI로 혈관 염색, (4) 결과 이미지 사진 촬영 및 TUNEL/DAPI 이중 양성 종의 백분율 정량화가 포함됩니다.
이 연구에서는 허혈/산화 스트레스 및 사이토카인과 같은 DM/DR 관련 모욕에 의해 유발된 사망에 대한 망막 혈관의 저항/취약성을 감지하기 위한 분석을 확립했습니다. 이 원고는 이 분석에 대한 상세한 설명을 제공하며, 이는 여러 공개된 프로토콜 19,20,21의 수정이다.
프로토콜은 몇 가지 중요한 단계를 포함합니다. 첫째, 망막을 꼼꼼하게 절개하여 혈관 네트워크를 보존하고 상당한 파열을 방지하는 것이 필수적입니다. 이것은 망막이 ora serrata에 단단히 부착되어 분리가 어렵기 때문에 변연 뒤쪽 2-3mm를 절개하여 수행할 수 있습니다. 둘째, 혈관과 접촉하는 모든 기구(예: 단모 브러시, 이송 피펫 및 겸자)를 절차 전반에 걸쳐 YL 트립신 용액에 담가 트립신으로 코팅합니다. 이렇게 하면 혈관이 이 프로토콜에 사용되는 기구에 달라붙는 것을 방지할 수 있습니다. 셋째, 미세혈관은 정상적인 조명 아래에서는 거의 보이지 않기 때문에 파편을 흡인하고 현미경 슬라이드로 옮기는 동안 우발적인 손실을 방지하기 위해 높은 경계가 필요합니다.
망막의 다양한 층의 적절한 수준의 효소 소화가 중요합니다. 소화가 불충분하면 신경 조직이 혈관 네트워크에서 분리되는 것을 방해하는 반면, 과도한 소화는 혈관 신경총을 용해시킵니다. 1시간19 분에서 하룻밤 23 분에 이르는 다양한 소화 시간이 보고되었다. 관찰에 따르면 4시간 15분의 분해 시간은 2시간, 3시간 및 4시간의 지속 시간에 비해 가장 유리한 결과를 산출합니다. 이 시점 이상으로 소화를 연장하는 것은 과정을 향상시키지 않을 것이며 대신 혈관 조직의 무결성을 손상시킬 수 있습니다.
소화된 망막이 단모 브러시에 부착된 경우 YL 트립신 용액에 모발을 여러 번 담그십시오. 이렇게 하면 브러시의 끈적끈적한 부분이 줄어듭니다. 헤어 브러시가 여전히 혈관 조직에 부착되어 있으면 유리체의 잔류 조각이 있는지 검사하고 집게로 제거하십시오.
유리체를 완전히 제거하기 위한 최적의 순간은 광수용체를 제거한 후 남아 있는 신경 및 신경교 조직을 제거하기 전입니다. 망막은 광수용체가 제거될 때까지 경직을 유지합니다. 이 단계에서 유리체를 추출하면 망막/혈관이 찢어질 수 있습니다. 잔여 신경 및 신경 교세포의 섬세한 층은 혈관 구조의 곡선 형태를 보존하는 데 중추적인 역할을 합니다. 유리체가 시신경에서 분리될 때 망막의 중심이 찢어지는 것을 방지합니다.
격리된 혈관이 현미경 슬라이드에 전혀 부착되지 않으면 접착이 발생할 것으로 예상되는 슬라이드 부분이 더러움을 나타냅니다. 슬라이드 표면을 가로질러 용기를 움직여 끈적끈적한 부분을 찾거나, 다른 슬라이드로 전환하거나, 슬라이드를 꼼꼼하게 청소한 후 다시 시도해 보십시오. 혈관이 그릇 모양으로 펼쳐지기 전에 슬라이드에 달라붙으면 슬라이드에서 혈관을 들어 올려 다시 한 번 물 속에서 자유롭게 떠오를 수 있도록 합니다. YL 트립신 용액에 반복적으로 담근 겸자를 사용하여 이 단계를 수행합니다.
혈관을 분리하기 위한 몇 가지 대안적인 기술이 보고되었는데, 이는 본원에 기술된 보호 검정에 적합하지 않을 것이다. 예를 들어, 삼투압 용해는 고정되지 않은 망막 샘플로부터 혈관 조직을 분리하기 위해 사용되어 조직24,25의 생화학적 조사를 용이하게 합니다. 그러나 이 절차는 혈관의 해부학적 구조와 이 기사에서 사용된 접근 방식을 보존하지 못할 수 있습니다. 유사하게, 미세혈관의 큰 분절을 분리하기 위한 조직 프린트 방법이 혈관계의 전기긴장 구조(26)의 분석을 가능하게 하는 반면, 전체 혈관층은 전형적으로 회복되지 않는다.
이 분석법은 모세관 변성을 모니터링하기 위한 기존 접근 방식이 보호 문제를 해결하지 못하기 때문에 개발되었습니다. 장기간의 DM 후에 발생하는 모세혈관 변성은 DR이 발생했는지 여부를 나타냅니다. DR을 진단하는 것 외에도 이 결과는 약제/요법이 DR을 예방하는지 여부를 평가하는 데 유용합니다. 그러나 기존의 모세관 변성 분석법은 약제의 근본적인 작용 기전을 설명하지 못합니다. 이러한 약제는 산화 스트레스 또는 사이토카인 증가와 같은 DR을 유발하는 병리학적 사건을 예방할 수 있다. 대안적으로, 제제는 산화 스트레스 및 사이토카인에 대한 복원력을 향상시킴으로써 보호를 시행할 수 있고/또는 손상의 복구를 촉진할 수 있다. 이 새로운 보호 분석법은 주어진 치료법의 유익한 효과가 DM 관련 사망으로부터 보호하는 내인성 시스템을 시행하는 것과 관련이 있는지 여부를 결정하는 데 사용할 수 있습니다.
이 보호 분석법의 단점은 망막 혈관 내의 두 가지 세포 유형, 즉 내피 세포(EC)와 주위 세포(PC)를 구별하지 못한다는 것입니다. PASH 염색 절편에서 핵의 모양은 세포 유형에 따라 다르지만(그림 6), 모든 핵이 진단 특징을 나타내는 것은 아닙니다. 핵의 약 30%는 적어도 부분적으로는 EC 또는 PC로 명확하게 정의할 수 없는데, 이는 PASH 염색 샘플에서 얻은 2차원 이미지가 혈관신경총의 3차원 구조를 불완전하게 분해하기 때문입니다. 이 장애물은 세포 유형별 마커를 사용한 면역형광 염색과 같은 추가 분석을 통해 극복할 수 있습니다. 두 가지 세포 유형을 구별하는 이러한 이미지는 TUNEL과 함께 염색하여 각 혈관 세포 유형의 저항성/취약성을 측정할 수 있습니다.
이 혈관 중심 분석은 신경 망막에 관한 정보를 제공하지 않습니다. 이러한 정보를 제공하기 위해 추가 분석을 개발할 수 있습니다. 예를 들어, 망막 혈관을 분리하는 대신 전체 망막의 단일 세포 현탁액을 생성한 다음 저항/취약성에 대해 분석(형광 활성화 세포 분류를 통해)할 수 있습니다. 세포 사멸 지표와 함께 세포 유형 특이적 마커(신경 및 혈관 모두)를 포함하면 DM/DR 매개 사멸로부터 보호할 수 있는 망막 세포 유형에 대한 보다 완전한 그림을 제공할 수 있습니다.
결론적으로, 본원에 기술된 보호 분석은 마우스에서 DM의 시작과 DR의 발현 사이의 지연에 책임이 있는 메커니즘을 조사하기 위한 강력한 접근법을 제공한다.
The authors have nothing to disclose.
이 연구는 일리노이 실명 예방 협회(Illinois Society to Prevent Blindness), 국립 보건원(National Institute of Health, EY031350 및 EY001792)의 보조금과 실명 예방 연구 재단(Research to Prevent Blindness Foundation)의 무제한 보조금으로 지원되었습니다.
10% neutral buffered formalin | Fischer Scientific | SF100-4 | Fixation |
24-well plates | Falcon | 353047 | |
33 G needle | Hamilton | customized | |
Ammonium hydroxide | Sigma | 221228-1L-PCA | |
C57/BL6/J mice | The Jackson Laboratory | Jax #000664 | |
Cytokine cocktail | consisted of a 1:1:1 ratio of 1 µg/mL TNF-α, 1 µg/mL IL-1 β and and 1500 U/µLIFN- γ | ||
Dissecting microscope | Any microscope that allows good visualization of the retina is adequate. | ||
Dumont #3 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11231-30 | Straight tips |
Dumont #5 forceps | Fine Science Tools (FST) | 11253-25 | Micro-blunted tips |
Easy-Grip Tissue Culture Dishes | Falcon | 353001 | 35 x 10 mm |
Glass transfer pipet | Fischer Scientific | 1367820A | snap off the thin end of a Pasteur pipet and fit the “broken” end with a rubber bulb. |
Harris modified hematoxylin | Sigma | HHS32 | |
Image J | NIH, Bethesda | https://imagej.nih.gov/ij/ | |
In Situ Cell Death Detection Kit, Fluorescein | Milipore | 11684795910 | TUNEL reaction mixture |
Micro cover glasses | VWR | 48366-227 | 22 mm x 22 mm |
Microknife | Sharpoint | 72-1551 | |
Micro-spatula | Fine Science Tools | 10091-12 | |
Mounting cassette | Any transparent cassette that is slightly bigger than the microscope slide | ||
Periodic acid | Sigma | 3951 | |
Periodic acid solution | 35 mM periodic acid with 12 mM sodium acetate in H2O | ||
Permount mounting medium | Fischer Scientific | SP15- 100 | |
Prism 9 | GraphPad | ||
Prolog Gold antifade reagent with DAPI | Invitrogen | P36935 | |
Recombinant human IFN- γ | Peprotec | 300-02 | |
Recombinant human IL-1 β | Peprotec | 200-01B | |
Recombinant human TNF-α | Peprotec | 300-01A | |
Schiff reagent base | Sigma | 3952016 | |
Shaker Incubator (belly button shaker) | IBI Scientific | BBUAAUV1S | |
Sodium acetate | Sigma | 71196 | |
Steritop sterile vacuum bottle | Millipore | SCGPS05RE | Create filtered water |
Superfrost Plus treated microscope slides | Fischer Scientific | 12-550-15 | use slides from unopened box |
Tert-butyl hydroperoxide (TBH) | Sigma | 75-91-2 | |
TRIZMA base | Fischer Scientific | 11-101-5522 | make 100 mM Tris, adjust pH to 7.8 using HCl) |
Trypsin 1:250 | Amresco | 0458-50G | |
Two “brushes” | made from single black hair taped to the end of plastic transfer pipet. One brush with a free end. The other brush with a loop | ||
Vannas Spring Scissors | Fine Science Tools (FST) | 15000-00 | |
Xylene | Sigma | 65351-M | |
YL trypsin solution | 3% trypsin in 0.1 M Tris (pH 7.8) | ||
Zeiss LSM 710 fluorescence microscope | Zeiss Microscopy |