Wiederverwendung von Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen bei proteomischen Analysen extrazellulärer Vesikel
Summary
Es wird ein detailliertes Protokoll für die Reinigung und Wiederverwendung von Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen zur Durchführung einer extrazellulären Vesikelisolierung bereitgestellt, die für Proteomik-Experimente geeignet ist.
Abstract
Einweg-Laborkunststoffe verschärfen die Verschmutzungskrise und tragen zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien bei. Bei der Isolierung von extrazellulären Vesikeln (EV) werden Polycarbonat-Ultrazentrifugenröhrchen (UC) verwendet, um den damit verbundenen hohen Zentrifugalkräften standzuhalten. Die EV-Proteomik ist ein fortschrittliches Gebiet, und es fehlen validierte Wiederverwendungsprotokolle für diese Röhrchen. Die Wiederverwendung von Verbrauchsmaterialien für Proteinisolierungsprotokolle mit geringer Ausbeute und nachgeschaltete Proteomik erfordert die Kompatibilität der Reagenzien mit Massenspektroskopie-Akquisitionen, wie z. B. das Fehlen einer Kontamination durch synthetische Polymere aus Zentrifugenröhrchen und eine ausreichende Entfernung von Restproteinen.
Dieses Protokoll beschreibt und validiert eine Methode zur Reinigung von Polycarbonat-UC-Röhrchen für die Wiederverwendung in EV-Proteomik-Experimenten. Der Reinigungsprozess umfasst das sofortige Eintauchen der UC-Schläuche in H2O, um ein Austrocknen der Proteine zu verhindern, das Waschen in 0,1 % Natriumdodecylsulfat (SDS)-Reinigungsmittel, das Spülen in heißem Leitungswasser, demineralisiertem Wasser und 70 % Ethanol. Um das Protokoll zur Wiederverwendung von UC-Röhrchen für die nachgeschaltete EV-Proteomik zu validieren, wurden verwendete Röhrchen nach einem Experiment gewonnen, bei dem EVs aus kardiovaskulärem Gewebe mittels differentieller UC- und Dichtegradiententrennung isoliert wurden. Die Röhrchen wurden gereinigt und der experimentelle Prozess wurde ohne EV-Proben wiederholt, wobei leere, nie verwendete UC-Röhrchen mit gereinigten UC-Röhrchen verglichen wurden. Die aus den Isolationsverfahren gewonnenen Pseudo-EV-Pellets wurden lysiert und für die Flüssigkeitschromatographie-Tandem-Massenspektrometrie unter Verwendung eines kommerziellen Proteinprobenvorbereitungskits mit Modifikationen für Proteinproben mit geringer Abundanz vorbereitet.
Nach der Reinigung wurde die Anzahl der identifizierten Proteine im Pseudo-Pellet im Vergleich zur vorherigen EV-Isolationsprobe aus demselben Röhrchen um 98 % reduziert. Beim Vergleich eines gereinigten Röhrchens mit einem leeren Röhrchen enthielten beide Proben eine sehr geringe Anzahl von Proteinen (≤20) mit einer Ähnlichkeit von 86 %. Das Fehlen von Polymerpeaks in den Chromatogrammen der gereinigten Röhren wurde bestätigt. Letztendlich wird die Validierung eines Reinigungsprotokolls für UC-Röhren, das für die Anreicherung von Elektrofahrzeugen geeignet ist, den von den EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die Versuchskosten senken.
Introduction
Extrazelluläre Vesikel (EVs) sind Lipid-Doppelschicht-abgegrenzte Partikel, die von Zellen freigesetzt werden, die biologisch aktive Fracht, wie z. B. Proteine, transportieren und an verschiedenen biologischen Prozessen beteiligt sind, einschließlich der Zell-Zell-Kommunikation und der Bildung biologischer Mineralisation1. Diese Partikel kommen in allen Körperflüssigkeiten und Geweben vor, und ihre biologischen Aktivitäten und Verwendungen sind ein sich schnell entwickelndes Gebiet der wissenschaftlichen Forschung. Die Isolierung und Validierung dieser Nanopartikel stellt aufgrund ihrer geringen Größe und Bioähnlichkeit mit anderen Partikeln wie Liposomen und Proteinaggregaten verschiedene Herausforderungen dar. Die neuesten Richtlinien der International Society of Extracellular Vesicles, Minimal information for studies of extracellular vesicles 2018 (MISEV2018), sind der anerkannte Standard für die wissenschaftliche Forschung im Bereich EV2.
Für die EV-Isolierung müssen je nach vorgelagerter Quelle und nachgeschalteten Anwendungen verschiedene Methoden, oft im Tandem, verwendet werden. Im Jahr 2015 war die gebräuchlichste primäre Isolationsmethode für EVs die differentielle Ultrazentrifugation (UC)2. Im Prinzip trennt die anfängliche Zentrifugation mit niedrigerer Geschwindigkeit größere oder dichtere unerwünschte Bestandteile wie Zellen und Zelltrümmer, so dass EVs im Überstand verbleiben. Anschließend verwendet UC eine sehr hohe Zentrifugalkraft, um EVs auszupelletieren und somit von anderen Partikeln zu trennen und zu reinigen, die kleiner oder weniger dicht sind, aber auch dichte Nicht-EV-Partikel enthalten können. Die meisten Protokolle verwenden häufig in dem einen oder anderen Schritt UC, um EVs aus einer Flüssigkeit zu isolieren3. Darüber hinaus wird UC in anderen Methoden der EV-Isolierung verwendet, wie z. B. der Dichtegradienten-Ultrazentrifugation (DGUC), bei der Medien wie OptiprepTM Iodixanol und Zentrifugalkraft verwendet werden, um EVs entsprechend ihrer Auftriebsdichtezu trennen 4. Es gibt auch andere Methoden der EV-Isolierung3.
In Anbetracht des sich schnell entwickelnden Verständnisses der biologischen Prozesse, die von EVs diktiert werden, und ihres Potenzials als Biomarker und Informationen zur Pathophysiologie haben forschungsbasierte Analysen wie die Proteomik an Bedeutung gewonnen 5,6,7,8. EVs sind klein und haben je nach Quelle eine geringe Proteinausbeute (<1 μg) im Vergleich zu Ganzgewebe- oder Zelllysat. Die Isolierung von EVs für die Proteomik-Analyse erfordert besondere Überlegungen, wie z. B. die Entfernung von Nicht-EV-Proteinverunreinigungen aus der vorgelagerten Flüssigkeit oder dem Gewebe, die Berücksichtigung des EV-Proteinabbaus während des Isolierungsprozesses und die Verwendung von Methoden zur Herstellung von Proteinlösungen, die chemisch mit Peptidpräparations- und Massenspektrometrieanalysen kompatibel sind.
Verbrauchsmaterialien für Forschungslabore sind oft aus Kunststoff und Einweg. Diese Einwegmaterialien tragen zur globalen Plastikverschmutzungskrise und zu den Kosten für Verbrauchsmaterialien bei. Spezialisierte UC-Rohre aus Polycarbonat und Polystyrol sind so konzipiert, dass sie den hohen Zentrifugalkräften standhalten, die zum Pelletieren von Elektrofahrzeugen in Laboranwendungen erforderlich sind. Während es möglich ist, UC-Röhrchen für die Wiederverwendung zu sterilisieren und zu desinfizieren, erfordert die proteomische Analyse, insbesondere bei niedrigen Proteinausbeuten wie z. B. EVs, besondere Aufmerksamkeit. Nicht nur die ausreichende Entfernung von Proteinresten aus der vorherigen Verwendung ist von größter Bedeutung, sondern auch die chemische Verträglichkeit mit Massenspektroskopie und kunststoffbedingter Polymerkontamination muss berücksichtigt werden.
Hier stellen wir ein Reinigungsprotokoll von Polycarbonattuben mit massenspektrometrischen Detergenzien vor und führen Experimente durch, um die erfolgreiche Entfernung von Proteinresten unterhalb der Nachweisgrenzen und das Fehlen von nachweisbaren Polymerverunreinigungen zu validieren. Um das Reinigungsprotokoll für proteomische EV-Anwendungen sowohl mit UC- als auch mit DGUC-Zwecken zu validieren, erhielten wir Röhrchen aus Isolationen von EVs aus humanem Gefäßgewebe mit einem kombinierten UC- und DGUC-Protokoll. Die Röhrchen wurden unter Verwendung des beschriebenen Protokolls gereinigt, und der experimentelle Prozess wurde ohne Proben wiederholt, bei denen eine leere, nie verwendete UC-Röhre mit einer gereinigten UC-Röhre verglichen wurde. Letztendlich wird die Validierung eines UC-Rohrreinigungsprotokolls, das für die Anreicherung von Elektrofahrzeugen geeignet ist, den von EV-Labors produzierten Abfall reduzieren und die mit solchen Experimenten verbundenen Kosten senken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Hier beschreiben und validieren wir ein Protokoll für die Reinigung von Polycarbonat-UC-Rohren für EV-Anreicherungs- und Proteomik-Anwendungen. Wir zeigten die erfolgreiche Entfernung von Restprotein aus der vorherigen UC-Röhrchenprobe im Vergleich zu einer gereinigten Pseudo-Pellet-Analyse unterhalb der Nachweisgrenze dieses Massenspektrometrie-Erfassungsprotokolls und zeigten die proteomische Ähnlichkeit von leeren, nie benutzten UC-Röhrchen im Vergleich zu gereinigten UC-Röhrchen-Pseudopellets.
<p class="jov…Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde durch ein Forschungsstipendium der National Institutes of Health Grants (NIH) R01HL147095, R01HL141917 und R01HL136431, Kowa Company, Ltd. und das Forschungs- und Innovationsprogramm Horizon 2020 der Europäischen Union im Rahmen des Marie-Skłodowska-Curie-Grant Agreement Nr. 101023041 (R. Cahalane) unterstützt. Abbildung 1 wurde mit Biorender.com erstellt. Das aktuelle Reinigungsprotokoll wurde durch die Änderung eines empfohlenen Schlauchreinigungsprotokolls entwickelt, das auf dem Bildungstag der International Society of Extracellular Vesicles 2023 (https://www.youtube.com/watch?v=DOebcOes6iI) vorgestellt wurde. Vielen Dank an Dr. Kathryn Howe und Dr. Sneha Raju vom University Health Network (University of Toronto, Kanada) für die originalen EV-Proben des Karotisgewebes.
Materials
| 10 mL Open-Top Thickwall Polycarbonate Tube | Beckman Coulter Life Sciences | 355630 | uncapped ultracentrifuge tube(s) |
| 10.4 mL Polycarbonate Bottle with Cap Assembly | Beckman Coulter Life Sciences | 355603 | capped ultracentrifuge tube(s) |
| an Acclaim PepMap 100 C18 HPLC Columns, 75 µm x 70 mm; and an EASY-Spray HPLC Column, 75 µm x 250 mm | ThermoFisher Scientific | 164946 and ES902 | Dual column setup |
| Critical Swab Swab, Cotton Head | VWR | 89031-270 | cotton swab |
| Exploris 480 fronted with EASY-Spray Source, coupled to an Easy-nLC1200 HPLC pump. | ThermoFisher Scientific | BRE725533 | Mass spectrometer |
| Human UniProt database (101043 entries, updated January 2022) | NA | NA | Human database |
| MilliQ water | water | ||
| PreOmics iST kit | PreOmics | P.O.00027 | commercial protein sample preparation kit |
| Proteome Discoverer package (PD, Version 2.5) | ThermoFisher Scientific | NA | Proteomic search software |
| SEQUEST-HT search algorithm | NA | NA | Search algorithm |
| Sodium Dodecyl Sulfate (20%) | Boston BioProducts | BM-230 | detergent |
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