JoVE Journal > Immunology and Infection
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
English

Automatically Generated
Immunology and Infection

Levende kalsiumavbildning av virusinfiserte humane intestinale organoidmonolag ved bruk av genetisk kodede kalsiumindikatorer

Published: January 19, 2024
doi:
10.3791/66132
, , ,
1Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology,Baylor College of Medicine

Summary

Denne protokollen beskriver en tilnærming for å utføre kalsiumavbildning i virusinfiserte humane tarmorganoider og tilbyr en tilnærming til analyse.

Abstract

Kalsiumsignalering er en integrert regulator av nesten alle vev. Innenfor tarmepitelet er kalsium involvert i regulering av sekretorisk aktivitet, aktindynamikk, inflammatoriske responser, stamcelleproliferasjon og mange andre ukarakteriserte cellulære funksjoner. Som sådan kan kartlegging av kalsiumsignaldynamikk i tarmepitelet gi innsikt i homeostatiske cellulære prosesser og avdekke unike responser på ulike stimuli. Humane intestinale organoider (HIO) er en høykapasitets, menneskeavledet modell for å studere tarmepitelet og dermed representere et nyttig system for å undersøke kalsiumdynamikk. Dette papiret beskriver en protokoll for å stabilt transdusere HIOer med genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECIs), utføre live fluorescensmikroskopi og analysere bildebehandlingsdata for å meningsfullt karakterisere kalsiumsignaler. Som et representativt eksempel ble 3-dimensjonale HIOer transdusert med lentivirus for stabilt å uttrykke GCaMP6s, en grønn fluorescerende proteinbasert cytosolisk GECI. De konstruerte HIO-ene ble deretter spredt i en encellesuspensjon og sådd som monolag. Etter differensiering ble HIO monolayers infisert med rotavirus og/eller behandlet med legemidler kjent for å stimulere en kalsiumrespons. Et epifluorescensmikroskop utstyrt med et temperaturkontrollert, fuktet levende bildekammer tillot langtidsavbildning av infiserte eller medikamentbehandlede monolag. Etter avbildning ble innhentede bilder analysert ved hjelp av den fritt tilgjengelige analyseprogramvaren, ImageJ. Samlet sett etablerer dette arbeidet en tilpasningsdyktig pipeline for karakterisering av cellulær signalering i HIOer.

Introduction

Kalsium er en vidt bevart andre budbringer som spiller en kritisk rolle i regulering av cellulær fysiologi1. Gitt sin sterke ladning, liten størrelse og høy oppløselighet under fysiologiske forhold, er kalsium en ideell manipulator av proteinkonformasjon. Dette gjør kalsium til et kraftig middel for å transdusere elektrokjemiske signaler til enzymatiske, transkripsjonelle eller posttranskripsjonelle endringer. De strenge kalsiumkonsentrasjonsgradientene over endoplasmatisk retikulum (ER) og plasmamembraner skaper en høy drivkraft som muliggjør raske endringer i cytosolisk kalsiumkonsentrasjon. Flere mekanismer, inkludert både bufring og aktiv transport, opprettholder denne gradienten tett. Selv om det er nødvendig for normale cellulære funksjoner, er dette vedlikeholdet energisk dyrt, noe som gjør det spesielt utsatt i tilstander av stress 2.

Som sådan er dysregulering av kalsium i cytosolen et nesten universelt signal om mange typer cellulær stress. Metabolske forstyrrelser, toksiner, patogener, mekanisk skade og genetiske forstyrrelser kan alle forstyrre kalsiumsignalering. Uavhengig av stimulansen, på helcellenivå, kan vedvarende, ukontrollerte økninger i cytosolisk kalsium fremme apoptose og til slutt nekrose 3,4. Endringer i cytosoliske kalsiumnivåer med lavere amplitude eller høyere frekvens har imidlertid varierende effekter2. På samme måte kan resultatene av kalsiumfluktuasjoner variere basert på det romlige mikrodomenet der de forekommer5. Overvåking av kalsiumnivåer kan derfor gi innsikt i dynamiske signalprosesser, men dette krever prøvetaking med relativt høy tidsmessig og romlig oppløsning.

Genetisk kodede kalsiumindikatorer (GECI) er kraftige verktøy for kontinuerlig prøvetaking i levende cellesystemer6. Noen av de mest brukte GECIene er GFP-baserte kalsiumresponsive fluorescerende proteiner kjent som GCaMPs7. Den kanoniske GCaMP er en fusjon av tre forskjellige proteindomener: en sirkulær permutert GFP (cpGFP), calmodulin og M136. Calmodulin-domenet gjennomgår en konformasjonsendring ved binding av kalsium, slik at dets interaksjon med M13. Calmodulin-M13-interaksjonen induserer en konformasjonsendring i cpGFP som øker dens fluorescerende utslipp ved eksitasjon. Som sådan korrelerer en økning i kalsiumkonsentrasjon med en økning i GCaMP-fluorescensintensitet. Disse sensorene kan være cytosoliske eller målrettet mot spesifikke organeller8.

I likhet med de fleste vev regulerer kalsium en rekke funksjoner i mage-tarmepitelet. Tarmepitelet er integrert for nærings- og væskeabsorpsjon, men må også danne en tett barriere og immungrensesnitt for å unngå patogeninvasjon eller giftige fornærmelser. Kalsiumavhengige veier påvirker nesten alle disse vitale funksjonene 9,10,11. Imidlertid er kalsiumsignalering i tarmepitelet fortsatt en underutforsket grense med lovende potensial som terapeutisk mål. Mens overvåking av kalsiumdynamikk i tarmepitelet in vivo fortsetter å presentere utfordringer, tilbyr humane tarmorganoider (HIO) et tilpasningsdyktig ex vivo-system for eksperimentering12. HIO er 3-dimensjonale (3D) sfæroider avledet fra humane intestinale stamceller, og ved differensiering rekapitulerer mye av det cellulære mangfoldet i det opprinnelige tarmepitelet12.

Denne protokollen beskriver omfattende metoder for å konstruere HIOer som uttrykker GECI og deretter forberede konstruerte HIOer som monolayers for kalsiumavbildning av levende celler. Det gir virusinfeksjon som et eksempel på en patologisk manipulasjon som forstyrrer kalsiumsignalering og gir en analytisk tilnærming for å kvantifisere disse endringene.

Protocol

Alle humane tarmorganoider (HIOer) som brukes i denne protokollen, og de representative forsøkene, ble avledet fra humant vev oppnådd og vedlikeholdt av Texas Medical Center Digestive Diseases Enteroid Core. Alle prøver ble samlet inn i samsvar med en protokoll godkjent av Institutional Review Board ved Baylor College of Medicine. 1. Fremstilling av materialer og reagenser For organoid vedlikehold, samle cellekulturbehandlede 24-brønnsplater, kjellermembranmatris…

Representative Results

Figur 1A viser en BMM-kuppel som inneholder 3-dimensjonale humane intestinale organoider som har blitt transdusert til stabilt uttrykke GCaMP6s. Figur 1B viser samme linje av organoid replisert som et monolag ved 24, 48 og 72 timer etter såing. For å validere funksjonen til GCaMP6s ble monolaget avbildet ved fluorescensmikroskopi hver 2 s i 4 minutter, og 100 nM ADP ble tilsatt mediet etter ~ 20 s. ADP fremkaller kalsiumfrigivelse fra endoplasmatisk retikulum,…

Discussion

Endringer i cytosoliske Ca2+ nivåer kan være både en årsak og virkning av patologier i epitelet 10,16,17. Økninger i cytosolisk kalsium kan direkte drive sekresjon via aktivering av den kalsiumavhengige kloridkanalenTMEM16A 18,19. Aktivering av TMEM16A som respons på Ca2+ muliggjør apikal utstrømning av klorid, og etablerer en osmotisk gradi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbeidet ble støttet av tilskudd R01DK115507 og R01AI158683 (PI: J. M. Hyser) fra National Institutes of Health (NIH). Traineestøtte ble gitt av NIH grants F30DK131828 (PI: J.T. Gebert), F31DK132942 (PI: F. J. Scribano) og F32DK130288 (PI: K.A. Engevik). Vi ønsker å takke Texas Medical Center fordøyelsessykdommer Enteroid Core for å gi organoid vedlikehold media.

Materials

Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
[Leu15]-Gastrin I Sigma-Aldrich G9145
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
0.05% Trypsin EDTA  Gibco  25300054
1.5mL microcentrifuge tubes Fisherbrand 5408137
15mL conical tubes Thermofisher Scientific 0553859A
16% formaldehyde Thermofisher Scientific 28906
1M HEPES Gibco 15630080
1M HEPES Gibco 15630080
1X PBS Corning  21-040-CV
25 gauge needle Thermofisher Scientific 1482113D
A-83-01 Tocris 2939
ADP Sigma-Aldrich  A2754
Advanced DMEM F12 Gibco 12634028
Antibiotic-antimycocytic  Gibco 15240062
Antibiotic-antimycotic  Gibco 15240062
B27 Supplement Gibco 17504-044
Bovine serum albumin FisherScientific  BP1600100
CellView Cell Culture Slide, PS, 75/25 MM, Glass Bottom, 10 compartments Greiner 543979
Collagen IV Sigma Aldrich C5533
DAPI Thermofisher Scientific D1306
EDTA Corning 46-034-CI
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fetal bovine serum  Corning  35010CV
Fluorobrite Gibco A1896701
GlutaMAX  Gibco  35050079
GlutaMAX  Gibco  35050079
Human epidermal growth factor ProteinTech HZ-1326
Lentivirus VectorBuilder (variable)
Matrigel BD Biosceicen 356231/CB40230C
N2 Supplement Gibco 17502-048
N-acetylcysteine Sigma-Aldrich A9165-5G
NH4Cl Sigma-Aldrich  A9434
Nicotinamide Sigma-Aldrich N0636
Nunc Cell Culture Treated 24-well Plates Thermofisher Scientific 142475
Polybrene MilliporeSigma TR1003G
SB202190 Sigma-Aldrich S70767
Triton X-100 Fisher BioReagents BP151100
TrypLE Express Enzyme, no phenol red Thermofisher Scientific 12604013
Trypsin Worthington Biochemical NC9811754
Y-27632 Tocris 1254
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Bootman, M. D., Bultynck, G. Fundamentals of cellular calcium signaling: A primer. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (1), a038802 (2020).
  2. Clapham, D. E. Calcium signaling. Cell. 131 (6), 1047-1058 (2007).
  3. Danese, A., et al. Cell death as a result of calcium signaling modulation: A cancer-centric prospective. Biochim Biophys Acta Mol Cell Res. 1868 (8), 119061 (2021).
  4. Harr, M. W., Distelhorst, C. W. Apoptosis and autophagy: Decoding calcium signals that mediate life or death. Cold Spring Harb Perspect Biol. 2 (10), a005579 (2010).
  5. Barak, P., Parekh, A. B. Signaling through Ca2+ microdomains from store-operated CRAC channels. Cold Spring Harb Perspect Biol. 12 (7), a035097 (2020).
  6. Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. A high signal-to-noise Ca(2+) probe composed of a single green fluorescent protein. Nat Biotechnol. 19 (2), 137-141 (2001).
  7. Erofeev, A. I., Vinokurov, E. K., Vlasova, O. L., Bezprozvanny, I. B. GCaMP, a family of single-fluorophore genetically encoded calcium indicators. J Evol Biochem Phys. 59 (4), 1195-1214 (2023).
  8. Suzuki, J., Kanemaru, K., Iino, M. Genetically encoded fluorescent indicators for organellar calcium imaging. Biophys J. 111 (6), 1119-1131 (2016).
  9. Nászai, M., Cordero, J. B. Intestinal stem cells: Got calcium. Curr Biol. 26 (3), R117-R119 (2016).
  10. Barrett, K. E. Calcium-mediated chloride secretion in the intestinal epithelium: Significance and regulation. Curr Top Membr. 53, 257-282 (2002).
  11. Xu, J., et al. Calcium-sensing receptor regulates intestinal dipeptide absorption via Ca2+ signaling and IKCa activation. Physiol Rep. 8 (1), e14337 (2020).
  12. Clevers, H. Modeling development and disease with organoids. Cell. 165 (7), 1586-1597 (2016).
  13. Lin, S. C., Haga, K., Zeng, X. L., Estes, M. K. Generation of CRISPR–Cas9-mediated genetic knockout human intestinal tissue–derived enteroid lines by lentivirus transduction and single-cell cloning. Nat Protoc. 17 (4), 1004-127 (2022).
  14. Crawford, S. E., Ramani, S., Blutt, S. E., Estes, M. K. Organoids to dissect gastrointestinal virus-host interactions: What have we learned. Viruses. 13 (6), 999 (2021).
  15. Lambert, T. J. FPbase: a community-editable fluorescent protein database. Nat Methods. 16 (4), 277-278 (2019).
  16. Lai, Y., et al. Inhibition of calcium-triggered secretion by hydrocarbon-stapled peptides. Nature. 603 (7903), 949-956 (2022).
  17. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus induces intercellular calcium waves through ADP signaling. Science. 370 (6519), eabc3621 (2020).
  18. Lee, B., et al. Anoctamin 1/TMEM16A controls intestinal Cl− secretion induced by carbachol and cholera toxin. Exp Mol Med. 51 (8), 1-14 (2019).
  19. Saha, T., et al. Intestinal TMEM16A control luminal chloride secretion in a NHERF1 dependent manner. Biochem Biophys Rep. 25, 100912 (2021).
  20. Mroz, M. S., Keely, S. J. Epidermal growth factor chronically upregulates Ca2+-dependent Cl− conductance and TMEM16A expression in intestinal epithelial cells. J Physiol. 590 (8), 1907-1920 (2012).
  21. Sui, J., et al. Dual role of Ca2+-activated Cl− channel transmembrane member 16A in lipopolysaccharide-induced intestinal epithelial barrier dysfunction in vitro. Cell Death Dis. 11 (5), 404 (2020).
  22. Bellono, N. W., et al. Enterochromaffin cells are gut chemosensors that couple to sensory neural pathways. Cell. 170 (1), 185-198.e16 (2017).
  23. Paradis, T., Bègue, H., Basmaciyan, L., Dalle, F., Bon, F. Tight junctions as a key for pathogens invasion in intestinal epithelial cells. Int J Mol Sci. 22 (5), 2506 (2021).
  24. Samak, G., et al. Calcium/Ask1/MKK7/JNK2/c-Src signalling cascade mediates disruption of intestinal epithelial tight junctions by dextran sulfate sodium. Biochem J. 465 (3), 503-515 (2015).
  25. Deng, H., Gerencser, A. A., Jasper, H. Signal integration by Ca2+ regulates intestinal stem cell activity. Nature. 528 (7581), 212-217 (2015).
  26. Saurav, S., Tanwar, J., Ahuja, K., Motiani, R. K. Dysregulation of host cell calcium signaling during viral infections: Emerging paradigm with high clinical relevance. Mol Aspects Med. 81, 101004 (2021).
  27. Chang-Graham, A. L., et al. Rotavirus calcium dysregulation manifests as dynamic calcium signaling in the cytoplasm and endoplasmic reticulum. Sci Rep. 9 (1), 10822 (2019).
  28. Hyser, J. M., Collinson-Pautz, M. R., Utama, B., Estes, M. K. Rotavirus disrupts calcium homeostasis by NSP4 viroporin activity. mBio. 1 (5), e00265-e00310 (2010).
  29. Pham, T., Perry, J. L., Dosey, T. L., Delcour, A. H., Hyser, J. M. The Rotavirus NSP4 viroporin domain is a calcium-conducting ion channel. Sci Rep. 7, 43487 (2017).
  30. Crawford, S. E., Hyser, J. M., Utama, B., Estes, M. K. Autophagy hijacked through viroporin-activated calcium/calmodulin-dependent kinase kinase-β signaling is required for rotavirus replication. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (50), E3405-E3413 (2012).
  31. Crawford, S. E., Criglar, J. M., Liu, Z., Broughman, J. R., Estes, M. K. COPII vesicle transport is required for Rotavirus NSP4 interaction with the autophagy protein LC3 II and trafficking to viroplasms. J Virol. 94 (1), e01341 (2019).
  32. Pando, V., Iša, P., Arias, C. F., Ló Pez, S. Influence of calcium on the early steps of Rotavirus infection. Virology. 295 (1), 190-200 (2002).
  33. Hyser, J. M., Estes, M. K. Pathophysiological consequences of calcium-conducting viroporins. Annu Rev Virol. 2 (1), 473-496 (2015).
  34. Strtak, A. C., et al. Recovirus NS1-2 has viroporin activity that induces aberrant cellular calcium signaling to facilitate virus replication. mSphere. 4 (5), e00506-e00519 (2019).
  35. In, J. G., Foulke-Abel, J., Clarke, E., Kovbasnjuk, O. Human colonoid monolayers to study interactions between pathogens, commensals, and host intestinal epithelium. J Vis Exp. (146), 59357 (2019).
  36. Hirota, A., AlMusawi, S., Nateri, A. S., Ordóñez-Morán, P., Imajo, M. Biomaterials for intestinal organoid technology and personalized disease modeling. Acta Biomater. 132, 272-287 (2021).
  37. Cevallos Porta, D., López, S., Arias, C. F., Isa, P. Polarized rotavirus entry and release from differentiated small intestinal cells. Virology. 499, 65-71 (2016).
  38. Mirabelli, C., et al. Human Norovirus efficiently replicates in differentiated 3D-human intestinal enteroids. J Virol. 96 (22), e0085522 (2022).
  39. Icha, J., Weber, M., Waters, J. C., Norden, C. Phototoxicity in live fluorescence microscopy, and how to avoid it. Bioessays. 39 (8), 28749075 (2017).
  40. Li, J., et al. Engineering of NEMO as calcium indicators with large dynamics and high sensitivity. Nat Methods. 20 (6), 918-924 (2023).

Tags

Calcium ImagingVirus-infectedHuman Intestinal OrganoidGenetically Encoded Calcium IndicatorsRotavirusParacrine Purinergic SignalingCalcium SignalingIntestinal EpitheliumLive ImagingGCaMP6sHIO Monolayers

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gebert, J. T., Scribano, F. J., Engevik, K. A., Hyser, J. M. Live Calcium Imaging of Virus-Infected Human Intestinal Organoid Monolayers Using Genetically Encoded Calcium Indicators. J. Vis. Exp. (203), e66132, doi:10.3791/66132 (2024).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image