Summary

Production de matrice extracellulaire cardiaque à partir de fibroblastes humains adultes pour l’enrobage de la boîte de culture

Published: March 22, 2024
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Summary

Des fibroblastes isolés du cœur humain adulte ont été cultivés jusqu’à la confluence sur des boîtes recouvertes de gélatine pour produire la matrice extracellulaire spécifique du myocarde. Après décellularisation, ce substrat peut être utilisé pour la culture et l’étude d’autres cellules cardiaques et des interactions cellule-matrice.

Abstract

Le myocarde est composé de cardiomyocytes et d’un nombre encore plus important de fibroblastes, ces derniers étant responsables de la production de matrice extracellulaire. Dès les premiers stades du développement cardiaque tout au long de la vie, dans des conditions normales et pathologiques, la composition de la matrice extracellulaire change et influence la structure et la fonction du myocarde. Le but de la méthode décrite ici est d’obtenir le substrat pour la culture de cellules cardiaques in vitro (appelée ECM cardiaque), en imitant la matrice extracellulaire myocardique in vivo. À cette fin, des fibroblastes isolés du cœur humain adulte ont été cultivés jusqu’à la confluence sur des boîtes recouvertes de gélatine pour produire la matrice extracellulaire spécifique du myocarde. L’ablation ultérieure des fibroblastes cardiaques, tout en préservant l’ECM cardiaque déposée, a produit le substrat pour l’étude de l’influence de la matrice extracellulaire spécifique du myocarde sur d’autres cellules. Il est important de noter que la composition du revêtement dérivé des fibroblastes de la boîte de culture change en fonction de l’activité in vivo des fibroblastes isolés du cœur, ce qui permet d’étudier ultérieurement les interactions cellule-matrice dans différentes conditions normales et pathologiques.

Introduction

Toutes les cellules sont situées in vivo dans un microenvironnement spécialisé dans lequel elles peuvent survivre et remplir leurs fonctions spécifiques. Dans un tissu donné, les cellules sont entourées d’une matrice extracellulaire composée de protéines fibrillaires et non fibrillaires, et de substances fondamentales riches en glycosaminoglycanes1. Les changements qualitatifs et quantitatifs dans le contenu de la matrice influencent la biologie cellulaire, contrôlant des processus tels que la prolifération cellulaire, l’apoptose, la migration ou la différenciation. Par conséquent, des efforts sont investis dans la recréation de ce microenvironnement pour des études in vitro de cellules de différents tissus 2,3.

Le myocarde est constitué de cardiomyocytes et d’une quantité encore plus grande de fibroblastes qui jouent un rôle essentiel dans la production et le maintien de la matrice extracellulaire dans le myocarde4. Tout au long de la vie, la composition de la matrice extracellulaire peut changer en réponse à divers facteurs normaux et pathologiques. Ces modifications de la composition de la matrice extracellulaire ont un impact significatif sur la structure et les caractéristiques biomécaniques du myocarde5. En conséquence, il devrait être avantageux pour la compréhension des interactions cellule-matrice dans le myocarde humain que le microenvironnement spécifique à différents âges ou conditions pathologiques ait été reproduit in vitro 6,7.

La méthode décrite ici vise à obtenir le substrat pour la culture de cellules cardiaques in vitro (appelée ECM cardiaque), imitant la matrice extracellulaire myocardique in vivo.

La recherche cardiovasculaire présente des défis spécifiques, notamment la difficulté d’obtenir des échantillons de donneurs vivants ou de patients et de cultiver des cellules cardiaques humaines8. La méthode présentée ici répond à ces défis en permettant l’acquisition de fibroblastes cardiaques même à partir de petits fragments bioptiques de myocarde humain et la culture in vitro de cellules cardiaques isolées sur leur matrice extracellulaire native typique du myocarde humain.

Alors que les efforts actuels se concentrent sur le développement d’échafaudages 3D de polymères synthétiques ou naturels biofartificiels qui imitent les propriétés biomécaniques du myocarde9 normal, ils négligent les interactions et la signalisation cellule-matrice qui se produisent dans des conditions normales et pathologiques. Étant donné que l’ECM cardiaque est synthétisée par des fibroblastes cardiaques dérivés du cœur humain, sa composition est déterminée par l’activité de ces cellules, qui changent en réponse à diverses conditions physiologiques et pathologiques, permettant ainsi l’étude de son influence spécifique sur la biologie des cellulescardiaques 10.

Le protocole actuel a été spécialement conçu pour le tissu cardiaque humain, mais sa base scientifique devrait également s’appliquer à d’autres organes, en particulier ceux à faible potentiel de régénération, à fibrose intense et à cicatrices influençant la structure et la fonction globales, ainsi qu’à un nombre et une taille d’échantillons limités.

Protocol

Des tissus cardiaques ont été prélevés chez des patients atteints d’insuffisance cardiaque terminale due à une cardiopathie ischémique qui subissaient une transplantation cardiaque. Tous les échantillons utilisés pour les expériences ont été collectés avec le consentement du patient et sans identification du patient, conformément aux protocoles approuvés par le comité d’éthique de l’Université de Naples Federico II et conformément aux principes énoncés dans la D…

Representative Results

La croissance des fibroblastes à partir des petits fragments de myocarde natif mis en culture a été observée dans les 3 à 5 jours (Figure 1). Dans les jours qui ont suivi, le nombre de fibroblastes a continué d’augmenter, peut-être en raison d’une croissance soutenue de l’échantillon de tissu cardiaque et de la prolifération de fibroblastes migrés à la surface de la boîte. Il ne faut pas s’attendre à ce que to…

Discussion

Les fibroblastes isolés d’échantillons de cœur humain ont été cultivés jusqu’à la confluence pendant 21 jours pour synthétiser et déposer la matrice extracellulaire, formant une couche cohésive fermement adhérente à la surface de la plaque de culture. L’ablation ultérieure des fibroblastes cardiaques, tout en préservant l’ECM cardiaque déposée, a produit le substrat pour l’étude de l’influence de la matrice extracellulaire spécifique du myocarde sur d’autr…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Aucun.

Materials

1 L laboratory bottle  VWR 215-1595 Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet Falcon 357551 Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate  VWR 391-0578 Clean and autoclave before use
100 mm plates Falcon 351029 Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes Falcon 352097 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses VWR 631-1570 Autoclave before use
25 mL serological pipet Falcon 357525 Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle  VWR 215-1593 Clean and autoclave before use
35 mm plates Falcon 353001 Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet Falcon 357543 Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes Falcon 352098 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle VWR 215-1594 Clean and autoclave before use
60 mm plates Falcon 353004 Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH) Sigma- Aldrich 338818 Liquid
Disposable scalpels VWR 233-5526 Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma- Aldrich D6429-500ml Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma- Aldrich F9665-500ml Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps VWR 232-1317 Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin Sigma- Aldrich G1890-100G Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma- Aldrich H1387-1L Powder
Large surgical scissors VWR 233-1211 Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors  Sigma- Aldrich S3146 Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin  Sigma- Aldrich P4333-100ml Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride Sigma- Aldrich P9333 Powder
Potassium Phosphate Monobasic Sigma- Aldrich P5665 Powder
Sodium Chloride  Sigma- Aldrich S7653 Powder
Sodium Phosphate Dibasic Sigma- Aldrich 94046 Powder
Stericup Filters Millipore S2GPU05RE Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes 
Triton X-100 Sigma- Aldrich 9002-93-1 Liquid
Trypsin-EDTA Sigma- Aldrich T4049-100ml Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes

References

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Nurzynska, D., Sacco, A. M., Servodio, V., Romano, V., Belviso, I., Castaldo, C., Di Meglio, F. Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating. J. Vis. Exp. (205), e66160, doi:10.3791/66160 (2024).

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