Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, wurden auf gelatinebeschichteten Schalen kultiviert, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Nach der Dezellularisierung kann dieses Substrat für die Kultivierung und Untersuchung anderer Herzzellen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen verwendet werden.
Das Myokard setzt sich aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Anzahl von Fibroblasten zusammen, wobei letztere für die Produktion der extrazellulären Matrix verantwortlich sind. Von den frühen Stadien der Herzentwicklung im Laufe des Lebens ändert sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen und beeinflusst die Struktur und Funktion des Myokards. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, auf gelatinebeschichteten Schalen so kultiviert, dass sie zusammenfließen, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf andere Zellen. Wichtig ist, dass sich die Zusammensetzung der von Fibroblasten abgeleiteten Beschichtung der Kulturschale entsprechend der in vivo-Aktivität der aus dem Herzen isolierten Fibroblasten ändert, was nachfolgende Untersuchungen von Zell-Matrix-Wechselwirkungen unter verschiedenen normalen und pathologischen Bedingungen ermöglicht.
Alle Zellen befinden sich in vivo in einer spezialisierten Mikroumgebung, in der sie überleben und ihre spezifischen Funktionen erfüllen können. Innerhalb eines Gewebes sind die Zellen von einer extrazellulären Matrix umgeben, die aus fibrillären und nicht-fibrillären Proteinen und grundlegenden Substanzen besteht, die reich an Glykosaminoglykanen sind1. Die qualitativen und quantitativen Veränderungen des Matrixgehalts beeinflussen die Zellbiologie und steuern Prozesse wie Zellproliferation, Apoptose, Migration oder Differenzierung. Daher werden Anstrengungen unternommen, um diese Mikroumgebung für In-vitro-Studien an Zellen aus verschiedenen Geweben nachzubilden 2,3.
Das Myokard besteht aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Menge an Fibroblasten, die eine entscheidende Rolle bei der Produktion und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix im Myokard spielen4. Im Laufe des Lebens kann sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix als Reaktion auf verschiedene normale und pathologische Faktoren ändern. Diese Modifikationen in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix haben einen signifikanten Einfluss auf die Struktur und die biomechanischen Eigenschaften des Myokards5. Dementsprechend sollte es für das Verständnis von Zell-Matrix-Wechselwirkungen innerhalb des menschlichen Myokards von Vorteil sein, wenn die Mikroumgebung, die für verschiedene Altersgruppen oder pathologische Zustände spezifisch ist, in vitro nachgebildet wird 6,7.
Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird.
Die kardiovaskuläre Forschung stellt besondere Herausforderungen dar, darunter die Schwierigkeit, Proben von Lebendspendern oder Patienten zu gewinnen und menschliche Herzzellen zu kultivieren8. Die hier vorgestellte Methode adressiert diese Herausforderungen, indem sie die Gewinnung von kardialen Fibroblasten auch aus kleinen bioptischen Fragmenten des menschlichen Myokards ermöglicht und die Kultivierung isolierter Herzzellen in vitro auf ihrer nativen extrazellulären Matrix, die für das humane Myokard typisch ist, ermöglicht.
Während sich die derzeitigen Bemühungen auf die Entwicklung von 3D-Gerüsten aus biokünstlichen synthetischen oder natürlichen Polymeren konzentrieren, die die biomechanischen Eigenschaften des normalen Myokards9 nachahmen, übersehen sie die Zell-Matrix-Wechselwirkungen und Signalwege, die sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen auftreten. Da die kardiale EZM von kardialen Fibroblasten synthetisiert wird, die aus dem menschlichen Herzen stammen, wird ihre Zusammensetzung durch die Aktivität dieser Zellen bestimmt, die sich als Reaktion auf verschiedene physiologische und pathologische Bedingungen ändert, was die Untersuchung ihres spezifischen Einflusses auf die kardiale Zellbiologie ermöglicht10.
Das derzeitige Protokoll wurde speziell für menschliches Herzgewebe entwickelt, aber seine wissenschaftliche Grundlage sollte auch für andere Organe gelten, insbesondere für solche mit geringem Regenerationspotenzial, intensiver Fibrose und Narbenbildung, die die Gesamtstruktur und -funktion beeinflussen, sowie begrenzten Probenzahlen und -größen.
Die aus menschlichen Herzproben isolierten Fibroblasten wurden 21 Tage lang bis zur Konfluenz kultiviert, um die extrazelluläre Matrix zu synthetisieren und abzulagern, wodurch eine kohäsive Schicht gebildet wird, die fest an der Oberfläche der Kulturplatte haftet. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf ander…
The authors have nothing to disclose.
Nichts.
1 L laboratory bottle | VWR | 215-1595 | Clean and autoclave before use |
10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
100 mm glass plate | VWR | 391-0578 | Clean and autoclave before use |
100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
22 mm x 22 mm cover glasses | VWR | 631-1570 | Autoclave before use |
25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
250 mL laboratory bottle | VWR | 215-1593 | Clean and autoclave before use |
35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
500 mL laboratory bottle | VWR | 215-1594 | Clean and autoclave before use |
60 mm plates | Falcon | 353004 | Treated, sterile cell culture dish |
Ammonium hydroxide (NH4OH) | Sigma- Aldrich | 338818 | Liquid |
Disposable scalpels | VWR | 233-5526 | Sterile and disposable |
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes |
Fine forceps | VWR | 232-1317 | Clean and autoclave before use |
Gelatin from porcine skin | Sigma- Aldrich | G1890-100G | Commercial Powder |
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
Large surgical scissors | VWR | 233-1211 | Clean and autoclave before use |
Microdissecting scissors | Sigma- Aldrich | S3146 | Clean and autoclave before use |
Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20°C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes |
Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
Stericup Filters | Millipore | S2GPU05RE | Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes |
Triton X-100 | Sigma- Aldrich | 9002-93-1 | Liquid |
Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes |