Summary

Herstellung von kardialer extrazellulärer Matrix aus adulten humanen Fibroblasten für die Beschichtung von Kulturschalen

Published: March 22, 2024
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Summary

Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, wurden auf gelatinebeschichteten Schalen kultiviert, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Nach der Dezellularisierung kann dieses Substrat für die Kultivierung und Untersuchung anderer Herzzellen und Zell-Matrix-Wechselwirkungen verwendet werden.

Abstract

Das Myokard setzt sich aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Anzahl von Fibroblasten zusammen, wobei letztere für die Produktion der extrazellulären Matrix verantwortlich sind. Von den frühen Stadien der Herzentwicklung im Laufe des Lebens ändert sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen und beeinflusst die Struktur und Funktion des Myokards. Der Zweck des hier beschriebenen Verfahrens besteht darin, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird. Zu diesem Zweck wurden Fibroblasten, die aus dem erwachsenen menschlichen Herzen isoliert wurden, auf gelatinebeschichteten Schalen so kultiviert, dass sie zusammenfließen, um die Myokard-spezifische extrazelluläre Matrix zu produzieren. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf andere Zellen. Wichtig ist, dass sich die Zusammensetzung der von Fibroblasten abgeleiteten Beschichtung der Kulturschale entsprechend der in vivo-Aktivität der aus dem Herzen isolierten Fibroblasten ändert, was nachfolgende Untersuchungen von Zell-Matrix-Wechselwirkungen unter verschiedenen normalen und pathologischen Bedingungen ermöglicht.

Introduction

Alle Zellen befinden sich in vivo in einer spezialisierten Mikroumgebung, in der sie überleben und ihre spezifischen Funktionen erfüllen können. Innerhalb eines Gewebes sind die Zellen von einer extrazellulären Matrix umgeben, die aus fibrillären und nicht-fibrillären Proteinen und grundlegenden Substanzen besteht, die reich an Glykosaminoglykanen sind1. Die qualitativen und quantitativen Veränderungen des Matrixgehalts beeinflussen die Zellbiologie und steuern Prozesse wie Zellproliferation, Apoptose, Migration oder Differenzierung. Daher werden Anstrengungen unternommen, um diese Mikroumgebung für In-vitro-Studien an Zellen aus verschiedenen Geweben nachzubilden 2,3.

Das Myokard besteht aus Kardiomyozyten und einer noch größeren Menge an Fibroblasten, die eine entscheidende Rolle bei der Produktion und Aufrechterhaltung der extrazellulären Matrix im Myokard spielen4. Im Laufe des Lebens kann sich die Zusammensetzung der extrazellulären Matrix als Reaktion auf verschiedene normale und pathologische Faktoren ändern. Diese Modifikationen in der Zusammensetzung der extrazellulären Matrix haben einen signifikanten Einfluss auf die Struktur und die biomechanischen Eigenschaften des Myokards5. Dementsprechend sollte es für das Verständnis von Zell-Matrix-Wechselwirkungen innerhalb des menschlichen Myokards von Vorteil sein, wenn die Mikroumgebung, die für verschiedene Altersgruppen oder pathologische Zustände spezifisch ist, in vitro nachgebildet wird 6,7.

Das hier beschriebene Verfahren zielt darauf ab, das Substrat für die Kultur von Herzzellen in vitro (kardiale EZM genannt) zu erhalten, wobei die myokardiale extrazelluläre Matrix in vivo nachgeahmt wird.

Die kardiovaskuläre Forschung stellt besondere Herausforderungen dar, darunter die Schwierigkeit, Proben von Lebendspendern oder Patienten zu gewinnen und menschliche Herzzellen zu kultivieren8. Die hier vorgestellte Methode adressiert diese Herausforderungen, indem sie die Gewinnung von kardialen Fibroblasten auch aus kleinen bioptischen Fragmenten des menschlichen Myokards ermöglicht und die Kultivierung isolierter Herzzellen in vitro auf ihrer nativen extrazellulären Matrix, die für das humane Myokard typisch ist, ermöglicht.

Während sich die derzeitigen Bemühungen auf die Entwicklung von 3D-Gerüsten aus biokünstlichen synthetischen oder natürlichen Polymeren konzentrieren, die die biomechanischen Eigenschaften des normalen Myokards9 nachahmen, übersehen sie die Zell-Matrix-Wechselwirkungen und Signalwege, die sowohl unter normalen als auch unter pathologischen Bedingungen auftreten. Da die kardiale EZM von kardialen Fibroblasten synthetisiert wird, die aus dem menschlichen Herzen stammen, wird ihre Zusammensetzung durch die Aktivität dieser Zellen bestimmt, die sich als Reaktion auf verschiedene physiologische und pathologische Bedingungen ändert, was die Untersuchung ihres spezifischen Einflusses auf die kardiale Zellbiologie ermöglicht10.

Das derzeitige Protokoll wurde speziell für menschliches Herzgewebe entwickelt, aber seine wissenschaftliche Grundlage sollte auch für andere Organe gelten, insbesondere für solche mit geringem Regenerationspotenzial, intensiver Fibrose und Narbenbildung, die die Gesamtstruktur und -funktion beeinflussen, sowie begrenzten Probenzahlen und -größen.

Protocol

Herzgewebe wurde von Patienten mit Herzinsuffizienz im Endstadium aufgrund einer ischämischen Kardiopathie gewonnen, die sich einer Herztransplantation unterzogen. Alle Proben, die für die Experimente verwendet wurden, wurden mit Zustimmung des Patienten und ohne Patientenidentifikatoren gemäß den von der Ethikkommission der Universität Neapel Federico II genehmigten Protokollen und in Übereinstimmung mit den in der Erklärung von Helsinki dargelegten Grundsätzen entnommen. Die Ei…

Representative Results

Das Auswachsen von Fibroblasten aus den kleinen Fragmenten des nativen Myokards, die in Kultur gebracht wurden, wurde innerhalb von 3-5 Tagen beobachtet (Abbildung 1). In den folgenden Tagen stieg die Anzahl der Fibroblasten weiter an, möglicherweise aufgrund des anhaltenden Auswachsens aus der Herzgewebeprobe und der Vermehrung migrierter Fibroblasten auf der Oberfläche der Schale. Es sollte nicht erwartet werden, dass alle Myo…

Discussion

Die aus menschlichen Herzproben isolierten Fibroblasten wurden 21 Tage lang bis zur Konfluenz kultiviert, um die extrazelluläre Matrix zu synthetisieren und abzulagern, wodurch eine kohäsive Schicht gebildet wird, die fest an der Oberfläche der Kulturplatte haftet. Die anschließende Entfernung von kardialen Fibroblasten unter Beibehaltung der abgelagerten kardialen EZM erzeugte das Substrat für die Untersuchung des Einflusses der myokardspezifischen extrazellulären Matrix auf ander…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Nichts.

Materials

1 L laboratory bottle  VWR 215-1595 Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet Falcon 357551 Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate  VWR 391-0578 Clean and autoclave before use
100 mm plates Falcon 351029 Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes Falcon 352097 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses VWR 631-1570 Autoclave before use
25 mL serological pipet Falcon 357525 Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle  VWR 215-1593 Clean and autoclave before use
35 mm plates Falcon 353001 Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet Falcon 357543 Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes Falcon 352098 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle VWR 215-1594 Clean and autoclave before use
60 mm plates Falcon 353004 Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH) Sigma- Aldrich 338818 Liquid
Disposable scalpels VWR 233-5526 Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma- Aldrich D6429-500ml Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma- Aldrich F9665-500ml Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps VWR 232-1317 Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin Sigma- Aldrich G1890-100G Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma- Aldrich H1387-1L Powder
Large surgical scissors VWR 233-1211 Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors  Sigma- Aldrich S3146 Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin  Sigma- Aldrich P4333-100ml Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride Sigma- Aldrich P9333 Powder
Potassium Phosphate Monobasic Sigma- Aldrich P5665 Powder
Sodium Chloride  Sigma- Aldrich S7653 Powder
Sodium Phosphate Dibasic Sigma- Aldrich 94046 Powder
Stericup Filters Millipore S2GPU05RE Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes 
Triton X-100 Sigma- Aldrich 9002-93-1 Liquid
Trypsin-EDTA Sigma- Aldrich T4049-100ml Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes

References

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Nurzynska, D., Sacco, A. M., Servodio, V., Romano, V., Belviso, I., Castaldo, C., Di Meglio, F. Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating. J. Vis. Exp. (205), e66160, doi:10.3791/66160 (2024).

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