Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo
Summary
Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.
Abstract
El miocardio está compuesto por cardiomiocitos y un número aún mayor de fibroblastos, siendo estos últimos los responsables de la producción de la matriz extracelular. Desde las primeras etapas del desarrollo del corazón a lo largo de la vida, tanto en condiciones normales como patológicas, la composición de la matriz extracelular cambia e influye en la estructura y función del miocardio. El objetivo del método aquí descrito es obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo. Con este fin, se cultivaron fibroblastos aislados del corazón humano adulto para que confluyeran en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células. Es importante destacar que la composición del recubrimiento derivado de fibroblastos de la placa de cultivo cambia de acuerdo con la actividad in vivo de los fibroblastos aislados del corazón, lo que permite estudios posteriores de las interacciones célula-matriz en diferentes condiciones normales y patológicas.
Introduction
Todas las células se encuentran in vivo en un microambiente especializado en el que pueden sobrevivir y llevar a cabo sus funciones específicas. Dentro de cualquier tejido, las células están rodeadas por una matriz extracelular compuesta por proteínas fibrilares y no fibrilares, y sustancias fundamentales ricas en glicosaminoglicanos1. Los cambios cualitativos y cuantitativos en el contenido de la matriz influyen en la biología celular, controlando procesos como la proliferación celular, la apoptosis, la migración o la diferenciación. Por lo tanto, se invierten esfuerzos en la recreación de este microambiente para estudios in vitro de células de diferentes tejidos 2,3.
El miocardio está formado por cardiomiocitos y una cantidad aún mayor de fibroblastos que desempeñan un papel fundamental en la producción y el mantenimiento de la matriz extracelular dentro del miocardio4. A lo largo de la vida, la composición de la matriz extracelular puede cambiar en respuesta a diversos factores normales y patológicos. Estas modificaciones en la composición de la matriz extracelular tienen un impacto significativo en la estructura y las características biomecánicas del miocardio5. En consecuencia, debería ser ventajoso para la comprensión de las interacciones célula-matriz dentro del miocardio humano si el microambiente específico de diferentes edades o condiciones patológicas se reprodujera in vitro 6,7.
El método aquí descrito tiene como objetivo obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo.
La investigación cardiovascular presenta desafíos específicos, incluyendo la dificultad para obtener muestras de donantes o pacientes vivos y cultivar células cardíacas humanas8. El método que aquí se presenta aborda estos desafíos al permitir la adquisición de fibroblastos cardíacos incluso a partir de pequeños fragmentos biópticos de miocardio humano y el cultivo de células cardíacas aisladas in vitro en su matriz extracelular nativa típica del miocardio humano.
Si bien los esfuerzos actuales se centran en el desarrollo de andamios 3D de polímeros sintéticos o naturales bioartificiales que imitan las propiedades biomecánicas del miocardionormal 9, pasan por alto las interacciones célula-matriz y la señalización que ocurren tanto en condiciones normales como patológicas. Dado que la MEC cardíaca es sintetizada por fibroblastos cardíacos derivados del corazón humano, su composición está determinada por la actividad de estas células, que cambia en respuesta a diversas condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite estudiar su influencia específica en la biología de las células cardíacas10.
El protocolo actual fue diseñado específicamente para el tejido cardíaco humano, pero su base científica también debe aplicarse a otros órganos, especialmente aquellos con bajo potencial de regeneración, fibrosis intensa y cicatrices que influyen en la estructura y función general, así como un número y tamaño de muestra limitados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los fibroblastos aislados de muestras de corazón humano se cultivaron hasta la confluencia durante 21 días para sintetizar y depositar la matriz extracelular, formando una capa cohesiva firmemente adherida a la superficie de la placa de cultivo. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células dentro del …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ninguno.
Materials
| 1 L laboratory bottle | VWR | 215-1595 | Clean and autoclave before use |
| 10 mL serological pipet | Falcon | 357551 | Sterile, polystyrene |
| 100 mm glass plate | VWR | 391-0578 | Clean and autoclave before use |
| 100 mm plates | Falcon | 351029 | Treated, sterile cell culture dish |
| 15 mL sterile tubes | Falcon | 352097 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 22 mm x 22 mm cover glasses | VWR | 631-1570 | Autoclave before use |
| 25 mL serological pipet | Falcon | 357525 | Sterile, polystyrene |
| 250 mL laboratory bottle | VWR | 215-1593 | Clean and autoclave before use |
| 35 mm plates | Falcon | 353001 | Treated, sterile cell culture dish |
| 5 mL serological pipet | Falcon | 357543 | Sterile, polystyrene |
| 50 mL sterile tubes | Falcon | 352098 | Centrifuge sterile tubes, polypropylene |
| 500 mL laboratory bottle | VWR | 215-1594 | Clean and autoclave before use |
| 60 mm plates | Falcon | 353004 | Treated, sterile cell culture dish |
| Ammonium hydroxide (NH4OH) | Sigma- Aldrich | 338818 | Liquid |
| Disposable scalpels | VWR | 233-5526 | Sterile and disposable |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Sigma- Aldrich | D6429-500ml | Store at 2-8 °C; avoid exposure to light |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Sigma- Aldrich | F9665-500ml | Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes |
| Fine forceps | VWR | 232-1317 | Clean and autoclave before use |
| Gelatin from porcine skin | Sigma- Aldrich | G1890-100G | Commercial Powder |
| Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) | Sigma- Aldrich | H1387-1L | Powder |
| Large surgical scissors | VWR | 233-1211 | Clean and autoclave before use |
| Microdissecting scissors | Sigma- Aldrich | S3146 | Clean and autoclave before use |
| Penicillin and Streptomycin | Sigma- Aldrich | P4333-100ml | Store at -20°C. The solution should be aliquoted into smaller working volumes |
| Potassium Chloride | Sigma- Aldrich | P9333 | Powder |
| Potassium Phosphate Monobasic | Sigma- Aldrich | P5665 | Powder |
| Sodium Chloride | Sigma- Aldrich | S7653 | Powder |
| Sodium Phosphate Dibasic | Sigma- Aldrich | 94046 | Powder |
| Stericup Filters | Millipore | S2GPU05RE | Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes |
| Triton X-100 | Sigma- Aldrich | 9002-93-1 | Liquid |
| Trypsin-EDTA | Sigma- Aldrich | T4049-100ml | Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes |
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