Summary

Producción de Matriz Extracelular Cardíaca a partir de Fibroblastos Humanos Adultos para el Recubrimiento de Placas de Cultivo

Published: March 22, 2024
doi:

Summary

Los fibroblastos aislados del corazón humano adulto se cultivaron para confluir en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. Después de la descelularización, este sustrato se puede utilizar para el cultivo y estudio de otras células cardíacas y las interacciones célula-matriz.

Abstract

El miocardio está compuesto por cardiomiocitos y un número aún mayor de fibroblastos, siendo estos últimos los responsables de la producción de la matriz extracelular. Desde las primeras etapas del desarrollo del corazón a lo largo de la vida, tanto en condiciones normales como patológicas, la composición de la matriz extracelular cambia e influye en la estructura y función del miocardio. El objetivo del método aquí descrito es obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo. Con este fin, se cultivaron fibroblastos aislados del corazón humano adulto para que confluyeran en placas recubiertas de gelatina para producir la matriz extracelular específica del miocardio. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células. Es importante destacar que la composición del recubrimiento derivado de fibroblastos de la placa de cultivo cambia de acuerdo con la actividad in vivo de los fibroblastos aislados del corazón, lo que permite estudios posteriores de las interacciones célula-matriz en diferentes condiciones normales y patológicas.

Introduction

Todas las células se encuentran in vivo en un microambiente especializado en el que pueden sobrevivir y llevar a cabo sus funciones específicas. Dentro de cualquier tejido, las células están rodeadas por una matriz extracelular compuesta por proteínas fibrilares y no fibrilares, y sustancias fundamentales ricas en glicosaminoglicanos1. Los cambios cualitativos y cuantitativos en el contenido de la matriz influyen en la biología celular, controlando procesos como la proliferación celular, la apoptosis, la migración o la diferenciación. Por lo tanto, se invierten esfuerzos en la recreación de este microambiente para estudios in vitro de células de diferentes tejidos 2,3.

El miocardio está formado por cardiomiocitos y una cantidad aún mayor de fibroblastos que desempeñan un papel fundamental en la producción y el mantenimiento de la matriz extracelular dentro del miocardio4. A lo largo de la vida, la composición de la matriz extracelular puede cambiar en respuesta a diversos factores normales y patológicos. Estas modificaciones en la composición de la matriz extracelular tienen un impacto significativo en la estructura y las características biomecánicas del miocardio5. En consecuencia, debería ser ventajoso para la comprensión de las interacciones célula-matriz dentro del miocardio humano si el microambiente específico de diferentes edades o condiciones patológicas se reprodujera in vitro 6,7.

El método aquí descrito tiene como objetivo obtener el sustrato para el cultivo de células cardíacas in vitro (denominado MEC cardíaca), imitando la matriz extracelular miocárdica in vivo.

La investigación cardiovascular presenta desafíos específicos, incluyendo la dificultad para obtener muestras de donantes o pacientes vivos y cultivar células cardíacas humanas8. El método que aquí se presenta aborda estos desafíos al permitir la adquisición de fibroblastos cardíacos incluso a partir de pequeños fragmentos biópticos de miocardio humano y el cultivo de células cardíacas aisladas in vitro en su matriz extracelular nativa típica del miocardio humano.

Si bien los esfuerzos actuales se centran en el desarrollo de andamios 3D de polímeros sintéticos o naturales bioartificiales que imitan las propiedades biomecánicas del miocardionormal 9, pasan por alto las interacciones célula-matriz y la señalización que ocurren tanto en condiciones normales como patológicas. Dado que la MEC cardíaca es sintetizada por fibroblastos cardíacos derivados del corazón humano, su composición está determinada por la actividad de estas células, que cambia en respuesta a diversas condiciones fisiológicas y patológicas, lo que permite estudiar su influencia específica en la biología de las células cardíacas10.

El protocolo actual fue diseñado específicamente para el tejido cardíaco humano, pero su base científica también debe aplicarse a otros órganos, especialmente aquellos con bajo potencial de regeneración, fibrosis intensa y cicatrices que influyen en la estructura y función general, así como un número y tamaño de muestra limitados.

Protocol

Se obtuvieron tejidos cardíacos de pacientes con insuficiencia cardíaca terminal por cardiopatía isquémica que estaban en tratamiento con trasplante cardíaco. Todos los especímenes utilizados para los experimentos se recogieron con el consentimiento del paciente y sin identificadores de paciente, siguiendo los protocolos aprobados por el comité de ética de la Universidad de Nápoles Federico II y de acuerdo con los principios descritos en la Declaración de Helsinki. Los detalles…

Representative Results

El crecimiento de los fibroblastos a partir de los pequeños fragmentos de miocardio nativo colocados en cultivo se observó en un plazo de 3 a 5 días (Figura 1). En los días siguientes, el número de fibroblastos continuó aumentando, posiblemente debido al crecimiento sostenido de la muestra de tejido cardíaco y la proliferación de fibroblastos migrados en la superficie de la placa. No debe esperarse que todos los fragmentos…

Discussion

Los fibroblastos aislados de muestras de corazón humano se cultivaron hasta la confluencia durante 21 días para sintetizar y depositar la matriz extracelular, formando una capa cohesiva firmemente adherida a la superficie de la placa de cultivo. La posterior extirpación de los fibroblastos cardíacos, al tiempo que se preservaba la MEC cardíaca depositada, produjo el sustrato para estudiar la influencia de la matriz extracelular específica del miocardio en otras células dentro del …

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Ninguno.

Materials

1 L laboratory bottle  VWR 215-1595 Clean and autoclave before use
10 mL serological pipet Falcon 357551 Sterile,  polystyrene
100 mm glass plate  VWR 391-0578 Clean and autoclave before use
100 mm plates Falcon 351029 Treated, sterile cell culture dish
15 mL sterile tubes Falcon 352097 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
22 mm x 22 mm cover glasses VWR 631-1570 Autoclave before use
25 mL serological pipet Falcon 357525 Sterile,  polystyrene
250 mL laboratory bottle  VWR 215-1593 Clean and autoclave before use
35 mm plates Falcon 353001 Treated, sterile cell culture dish
5 mL serological pipet Falcon 357543 Sterile, polystyrene
50 mL sterile tubes Falcon 352098 Centrifuge sterile tubes, polypropylene
500 mL laboratory bottle VWR 215-1594 Clean and autoclave before use
60 mm plates Falcon 353004 Treated, sterile cell culture dish
Ammonium hydroxide (NH4OH) Sigma- Aldrich 338818 Liquid
Disposable scalpels VWR 233-5526 Sterile and disposable
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) Sigma- Aldrich D6429-500ml Store at 2-8 °C; avoid exposure to light
Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma- Aldrich F9665-500ml Store at -20 °C. The serum should be aliquoted into smaller working volumes
Fine forceps VWR 232-1317 Clean and autoclave before use
Gelatin from porcine skin Sigma- Aldrich G1890-100G Commercial Powder
Hank's Balanced Salt Solution (HBSS) Sigma- Aldrich H1387-1L Powder
Large surgical scissors VWR 233-1211 Clean and autoclave before use
Microdissecting scissors  Sigma- Aldrich S3146 Clean and autoclave before use
Penicillin and Streptomycin  Sigma- Aldrich P4333-100ml Store at -20°C. The solution  should be aliquoted into smaller working volumes
Potassium Chloride Sigma- Aldrich P9333 Powder
Potassium Phosphate Monobasic Sigma- Aldrich P5665 Powder
Sodium Chloride  Sigma- Aldrich S7653 Powder
Sodium Phosphate Dibasic Sigma- Aldrich 94046 Powder
Stericup Filters Millipore S2GPU05RE Sterile and disposable 0.22 mm filter membranes 
Triton X-100 Sigma- Aldrich 9002-93-1 Liquid
Trypsin-EDTA Sigma- Aldrich T4049-100ml Store at -20 °C. It should be aliquoted into smaller working volumes

References

  1. Gattazzo, F., Urciuolo, A., Bonaldo, P. Extracellular matrix: A dynamic microenvironment for stem cell niche. Biochim Biophys Acta. 1840 (8), 2506-2519 (2014).
  2. Zhang, Y., et al. Tissue-specific extracellular matrix coatings for the promotion of cell proliferation and maintenance of cell phenotype. Biomaterials. 30 (23-24), 4021-4028 (2009).
  3. Xing, H., Lee, H., Luo, L., Kyriakides, T. R. Extracellular matrix-derived biomaterials in engineering cell function. Biotechnol Adv. 42, 107421 (2020).
  4. Andrés-Delgado, L., Mercader, N. Interplay between cardiac function and heart development. Biochim Biophys Acta. 1863 (7), 1707-1716 (2016).
  5. Hall, C., Gehmlich, K., Denning, C., Pavlovic, D. Complex relationship between cardiac fibroblasts and cardiomyocytes in health and disease. J Am Heart Assoc. 10 (5), e019338 (2021).
  6. Castaldo, C., Chimenti, I. Cardiac progenitor cells: The matrix has you. Stem Cells Transl Med. 7, 506-510 (2018).
  7. Nurzynska, D., Iruegas, M. E., Castaldo, C., Müller-Best, P., Di Meglio, F. Application of biotechnology in myocardial regeneration-tissue engineering triad: cells, scaffolds, and signaling molecules. Biomed Res Int. 2013, 236893 (2013).
  8. Giacca, M. Cardiac regeneration after myocardial infarction: An approachable goal. Curr Cardiol Rep. 22 (10), 122 (2020).
  9. Spedicati, M., et al. Biomimetic design of bioartificial scaffolds for the in vitro modeling of human cardiac fibrosis. Front Bioeng Biotechnol. 10, 983782 (2022).
  10. Souders, C. A., Bowers, S. L., Baudino, T. A. Cardiac fibroblast: The renaissance cell. Circ Res. 105 (12), 1164-1176 (2009).
  11. Castaldo, C., et al. Cardiac fibroblast-derived extracellular matrix (biomatrix) as a model for the studies of cardiac primitive cell biological properties in normal and pathological adult human heart. Biomed Res Int. 2013, 352370 (2013).
  12. Nurzynska, D., et al. In vitro produced cardiac extracellular matrix for studies of myocardium regeneration potential. Tissue Eng Part A. 21, 77 (2015).
  13. VanWinkle, W. B., Snuggs, M. B., Buja, L. M. Cardiac ECM: A biosynthetic extracellular matrix for cardiomyocyte culture. In Vitro Cell Dev Biol Anim. 32, 478-485 (1996).
  14. Santhakumar, R., Vidyasekar, P., Verma, R. S. Cardiac ECM: A nano-matrix scaffold with potential application in cardiac regeneration using mesenchymal stem cells. PLoS One. 9 (12), e114697 (2014).
  15. Gopal, S., Multhaupt, H. A. B., Couchman, J. R. Calcium in cell-extracellular matrix interactions. Adv Exp Med Biol. 1131, 1079-1102 (2020).
  16. Hellewell, A. L., Rosini, S., Adams, J. C. A Rapid, scalable method for the isolation, functional study, and analysis of cell-derived extracellular matrix. J Vis Exp. (119), e55051 (2017).
  17. Nurzynska, D., Di Meglio, F., Montagnani, S., Castaldo, C., Hayat, M. A. Cardiac stem cells derived from epithelial-mesenchymal transition of epicardial cells: role in heart regeneration (method). Stem Cells and Cancer Stem Cells, vol. 5: Therapeutic Applications in Disease and Injury. , 109-115 (2012).
  18. Pagano, F., et al. Normal versus pathological cardiac fibroblast-derived extracellular matrix differentially modulates cardiosphere-derived cell paracrine properties and commitment. Stem Cells Int. 2017, 7396462 (2017).
  19. Xu, Y., et al. Vitamin C regulates the profibrotic activity of fibroblasts in in vitro replica settings of myocardial infarction. Int J Mol Sci. 24 (9), 8379 (2023).
  20. Jaffré, F., et al. Serotonin and angiotensin receptors in cardiac fibroblasts coregulate adrenergic-dependent cardiac hypertrophy. Circ Res. 104 (1), 113-123 (2009).
  21. Błyszczuk, P., et al. Activated cardiac fibroblasts control contraction of human fibrotic cardiac microtissues by a β-adrenoreceptor-dependent mechanism. Cells. 9 (5), 1270 (2020).
  22. Duval, K., et al. Modeling physiological events in 2D vs. 3D cell culture. Physiol. 32 (4), 266-277 (2017).
  23. Ungerleider, J. L., et al. Fabrication and characterization of injectable hydrogels derived from decellularized skeletal and cardiac muscle. Methods. 84, 53-59 (2015).
  24. Seo, Y., et al. Decellularized heart ECM hydrogel using supercritical carbon dioxide for improved angiogenesis. Acta Biomater. 67, 270-281 (2018).
  25. Liguori, G. R., et al. Molecular and biomechanical clues from cardiac tissue decellularized extracellular matrix drive stromal cell plasticity. Front Bioeng Biotechnol. 8, 520 (2020).
  26. Silva, A. C., Pereira, C., Fonseca, A. C. R. G., Pinto-do-Ó, P., Nascimento, D. S. Bearing my heart: The role of extracellular matrix on cardiac development, homeostasis, and injury response. Front Cell Dev Biol. 8, 621644 (2021).

Play Video

Cite This Article
Nurzynska, D., Sacco, A. M., Servodio, V., Romano, V., Belviso, I., Castaldo, C., Di Meglio, F. Production of Cardiac Extracellular Matrix from Adult Human Fibroblasts for Culture Dish Coating. J. Vis. Exp. (205), e66160, doi:10.3791/66160 (2024).

View Video