Summary

طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لتحليل زراعة الأعضاء في الأورام في أجنة الزرد الشفافة

Published: July 12, 2024
doi:

Summary

وصفنا بروتوكولا لزرع الأجانب في صفار أجنة الزرد الشفافة التي يتم تحسينها بطريقة مرحلية بسيطة وسريعة. تشمل تحليلات ما بعد الحقن البقاء على قيد الحياة وتقييم عبء المرض للخلايا المزروعة بالأجانب عن طريق قياس التدفق الخلوي.

Abstract

في الجسم الحي دراسات سلوك الورم هي عنصر أساسي في أبحاث السرطان. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران يمثل تحديات كبيرة في التكلفة والوقت. هنا ، نقدم يرقات الزرد كنموذج زرع له مزايا عديدة على نماذج الفئران ، بما في ذلك سهولة التعامل ، والتكلفة المنخفضة ، والمدة التجريبية القصيرة. علاوة على ذلك ، فإن عدم وجود نظام مناعي تكيفي خلال مراحل اليرقات يغني عن الحاجة إلى توليد واستخدام سلالات نقص المناعة. في حين توجد بروتوكولات راسخة لزراعة الأعضاء في أجنة الزرد ، فإننا نقدم هنا طريقة محسنة تتضمن تحديد مراحل الجنين من أجل النقل الأسرع وتحليل البقاء على قيد الحياة واستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم عبء المرض. يتم تنظيم الأجنة لتسهيل الحقن السريع للخلايا في صفار اليرقات وعلامات الخلايا لمراقبة اتساق بلعة الخلايا المحقونة. بعد الحقن ، يتم تقييم تحليل بقاء الجنين لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة). أخيرا ، يتم تقييم عبء المرض أيضا عن طريق وضع علامة على الخلايا المنقولة ببروتين فلوري وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تمكين قياس التدفق الخلوي من خلال طريقة موحدة لإعداد معلقات الخلايا من أجنة الزرد ، والتي يمكن استخدامها أيضا في إنشاء الثقافة الأولية لخلايا الزرد. باختصار ، يسمح الإجراء الموصوف هنا بإجراء تقييم أسرع لسلوك الخلايا السرطانية في الجسم الحي مع أعداد أكبر من لكل ذراع دراسة وبطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة.

Introduction

يعد تحليل سلوك الأورام استجابة للتغيير الجيني أو العلاج الدوائي في الجسم الحي عنصرا أساسيا في أبحاث السرطان1،2،3،4. غالبا ما تتضمن هذه الدراسات استخدام نماذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة (Mus musculus)5 ؛ ومع ذلك ، فإن دراسات زراعة الأعضاء الخارجية في الفئران محدودة في كثير من النواحي ، بما في ذلك السعة المحدودة ، والمدة الممتدة ، والنفقات الكبيرة ، والحاجة إلى معدات تصوير متطورة لمراقبة تطور الأورام الداخلية 6,7. على النقيض من ذلك ، يتيح نموذج الزرد (Danio rerio) سعة أكبر ، ومدة أقصر ، ونفقات أقل ، وبسبب شفافيتها ، مراقبة بسيطة لتطور المرض 8,9.

الزرد هو نظام نموذجي متطور للفقاريات مع تطور خارج الرحم وخصوبة عالية ، حيث تنتج الإناث الفردية أكثر من 100 جنين10. علاوة على ذلك ، فإن أجنة الزرد شفافة ، مما يتيح تصورا سهلا للعمليات التنموية باستخدام التقنيات المتعلقة بالتألق مثل المراسلين. أخيرا ، فإن الحفاظ على العمليات التنموية الحرجة يجعلها نموذجا مثاليا للعديد من أنواع الدراسات ، بما في ذلك سلوك الخلايا الخبيثة المزروعة11,12. تطور أجنة الزرد من النوع البري الخلايا الصباغية ، مما يجعلها معتمة بصريا بحلول 2 أسابيع من العمر ، ولكن تم التغلب على ذلك من خلال توليد أجنة كاسبر (roya9; MitfaW2) ، والتي تظل شفافة طوال الحياة13. بسبب خصائصها البصرية ، فإن الزرد كاسبر هي المتلقين المثاليين للخلايا السرطانية المزروعة14،15،16. اكتسبت زراعة الخلايا السرطانية في الزرد أهمية في العقدين الماضيين17،18،19،20،21. أجنة الزرد لها مناعة فطرية. ومع ذلك ، فإنها تفتقر إلى المناعة التكيفية خلال مرحلة اليرقات ، مما يجعلها منقوصة المناعة وظيفيا ، مما يمكنها من العمل كمضيفين فعالين للطعوم الخارجية للورمالمزروع 22.

تم تطوير بروتوكولات لتطعيم الورم في أجنة الزرد وكذلك البالغين الذين أخذوا في الاعتبار عددا من المتغيرات المختلفة23،24،25،26،27. وقد استكشفت هذه العديد من مواقع ترسب الورم في الزرد ، بما في ذلك الحقن في صفار البيض ، والفضاء شبه vitelline ، والقلب وفي مراحل النمو المختلفة16،28. كما أن درجة الحرارة المحيطة للاستزراع المائي للطعوم الخارجية لأسماك الزرد مهمة أيضا حيث أن تربية أسماك الزرد تحدث عادة عند 28 درجة مئوية، بينما تنمو خلايا الثدييات عند 37 درجة مئوية. وبالتالي ، يجب استخدام درجة حرارة توفيقية تتحملها الأسماك ولكنها تدعم نمو الورم ، ويبدو أن 34 درجة مئوية تحقق كلا الهدفين29. يعد تحليل سلوك الأورام وتطورها بعد زراعة الأعضاء الخارجية مجالا رئيسيا آخر للتركيز ، وهذا ينطوي على استخدام مجموعة متنوعة من طرق التصوير بالإضافة إلى تحليل البقاء على قيد الحياة30. واحدة من المزايا الرئيسية لنموذج الزرد هو توافر أعداد كبيرة من الدراسة لتوفير قوة إحصائية هائلة للدراسات في الجسم الحي لسلوك الورم. ومع ذلك ، فقد حدت الأساليب السابقة بشدة من هذه الإمكانات بسبب متطلبات إجراءات التركيب المملة للحقن.

هنا ، نعالج هذا القيد من خلال تطوير طريقة بسيطة وسريعة يمكن من خلالها تحديد مرحلة الأجنة التي تتيح إنتاجية عالية ومراقبة جودة الحقن باستخدام خط الزرد كاسبر الشفاف. وهذا يستلزم حقن الطعوم الخارجية في كيس صفار أجنة الزرد كاسبر في 2 أيام بعد الإخصاب (dpf). نلاحظ بقاء الأجنة بعد زراعة الأعضاء كجزء من تحليل سلوك الورم. نعرض كذلك تقييم عبء المرض بعد زراعة الأعضاء عن طريق إجراء معلقات أحادية الخلية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 1).

Protocol

وقد تمت صيانة أسماك الزرد وتغذيتها وتربيتها في ظروف الاستزراع المائي القياسية عند 28.5 درجة مئوية، كما هو موضح31. تم إجراء جميع التجارب المتعلقة بالزرد عند درجة الحرارة هذه. ومع ذلك ، بعد زراعة الأجانب ، تم استزراع عند 34 درجة مئوية طوال مدة التجربة ، وفقا للإجراءات المعتمدة من قب…

Representative Results

زرع الأعضاءيوضح الشكل 1 عرضا شاملا للتجربة والتحليل بأكملهما ، بدءا من إنتاج الجنين إلى تقييم تطور المرض من خلال كل من تحليل البقاء على قيد الحياة وعبء المرض عن طريق قياس التدفق الخلوي. يجلب هذا النهج العديد من التحسينات التي تعزز قابلية استنساخ وقابلية التوسع ?…

Discussion

برزت زراعة الأجانب لسمك الزرد كبديل سريع وقوي وفعال من حيث التكلفة لدراسات الفئران12. على الرغم من الإبلاغ عن عدة طرق لزراعة الزرد ، فقد أدى تكيفنا إلى تحسينات كبيرة. بالإضافة إلى توحيد المعلمات حول الإجراء ، تركز هذه التحسينات بشكل خاص على تسريع معدل إجراء حقن الورم ، وبالتال?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R37AI110985 و P30CA006927 ، وهو اعتماد من كومنولث بنسلفانيا ، وجمعية اللوكيميا والأورام اللمفاوية ، وصندوق الأسقف. تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل المرافق الأساسية في Fox Chase ، بما في ذلك زراعة الخلايا ، وقياس التدفق الخلوي ، ومنشأة المختبر. نشكر الدكتورة جينيفر رودس على صيانة مرفق الزرد والحقن المجهري في FCCC.

Materials

1-phenyl 2-thiourea (PTU) Sigma P7629
70 micron cell strainer Corning  CLS431751-50EA
90 mm Petri dish Thermo Fisher Scientific S43565
Agarose Apex bioresearch 20-102GP
APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody Biolegend 109814
BD FACSymphony A5 Cell Analyzer BD Biosciences BD FACSymphony A5
calibration capillaries Sigma  P1424-1PAK
Cell tracker CM-dil dye Invitrogen C7001
Collageanse IV Gibco 17104019
Dumont forceps number 55 Fine science tools 11255-20
FBS Corning  35-015-CV
Fluorescence microscope Nikon model SMZ1500
Glass capillaries (Borosilicate) World precision instruments 1B100-4
HBSS Corning  21-023-CV
Helix NP Blue Biolegend 425305
Instant Ocean Sea Salt Instant ocean SS15-10
Light microscope Nikon model SMZ1000
Methylene blue Sigma M9140-100G
Microloader (long tips for laoding cells) eppendorf 930001007
P1000 micropipette puller Sutter instruments model P-97
PM 1000 cell microinjector MicroData Instruments, Inc. (MDI) PM1000
Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) Sigma E10521-10G
Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red Gibco 15400054
Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) Zeigler 388763

References

  1. Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
  2. Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
  3. Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
  4. Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
  5. Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
  6. Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
  7. Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
  8. Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
  9. MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
  10. Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
  11. White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
  12. Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
  13. White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
  14. Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
  15. Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
  16. Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
  17. Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
  18. Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
  19. Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
  20. Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
  21. Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
  22. Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
  23. Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
  24. Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
  25. Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
  26. Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
  27. Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
  28. Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
  29. Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
  30. Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
  31. Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
  32. Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
  33. Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
  34. Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
  35. Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
  36. Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
  37. Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
  38. Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).

Play Video

Cite This Article
Verma, M., Rhodes, M., Shinton, S., Wiest, D. L. A Simple, Rapid, and Effective Method for Tumor Xenotransplantation Analysis in Transparent Zebrafish Embryos. J. Vis. Exp. (209), e66164, doi:10.3791/66164 (2024).

View Video