طريقة بسيطة وسريعة وفعالة لتحليل زراعة الأعضاء في الأورام في أجنة الزرد الشفافة
Summary
وصفنا بروتوكولا لزرع الأجانب في صفار أجنة الزرد الشفافة التي يتم تحسينها بطريقة مرحلية بسيطة وسريعة. تشمل تحليلات ما بعد الحقن البقاء على قيد الحياة وتقييم عبء المرض للخلايا المزروعة بالأجانب عن طريق قياس التدفق الخلوي.
Abstract
في الجسم الحي دراسات سلوك الورم هي عنصر أساسي في أبحاث السرطان. ومع ذلك ، فإن استخدام الفئران يمثل تحديات كبيرة في التكلفة والوقت. هنا ، نقدم يرقات الزرد كنموذج زرع له مزايا عديدة على نماذج الفئران ، بما في ذلك سهولة التعامل ، والتكلفة المنخفضة ، والمدة التجريبية القصيرة. علاوة على ذلك ، فإن عدم وجود نظام مناعي تكيفي خلال مراحل اليرقات يغني عن الحاجة إلى توليد واستخدام سلالات نقص المناعة. في حين توجد بروتوكولات راسخة لزراعة الأعضاء في أجنة الزرد ، فإننا نقدم هنا طريقة محسنة تتضمن تحديد مراحل الجنين من أجل النقل الأسرع وتحليل البقاء على قيد الحياة واستخدام قياس التدفق الخلوي لتقييم عبء المرض. يتم تنظيم الأجنة لتسهيل الحقن السريع للخلايا في صفار اليرقات وعلامات الخلايا لمراقبة اتساق بلعة الخلايا المحقونة. بعد الحقن ، يتم تقييم تحليل بقاء الجنين لمدة تصل إلى 7 أيام بعد الحقن (نقطة في البوصة). أخيرا ، يتم تقييم عبء المرض أيضا عن طريق وضع علامة على الخلايا المنقولة ببروتين فلوري وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي. يتم تمكين قياس التدفق الخلوي من خلال طريقة موحدة لإعداد معلقات الخلايا من أجنة الزرد ، والتي يمكن استخدامها أيضا في إنشاء الثقافة الأولية لخلايا الزرد. باختصار ، يسمح الإجراء الموصوف هنا بإجراء تقييم أسرع لسلوك الخلايا السرطانية في الجسم الحي مع أعداد أكبر من لكل ذراع دراسة وبطريقة أكثر فعالية من حيث التكلفة.
Introduction
يعد تحليل سلوك الأورام استجابة للتغيير الجيني أو العلاج الدوائي في الجسم الحي عنصرا أساسيا في أبحاث السرطان1،2،3،4. غالبا ما تتضمن هذه الدراسات استخدام نماذج الفئران التي تعاني من نقص المناعة (Mus musculus)5 ؛ ومع ذلك ، فإن دراسات زراعة الأعضاء الخارجية في الفئران محدودة في كثير من النواحي ، بما في ذلك السعة المحدودة ، والمدة الممتدة ، والنفقات الكبيرة ، والحاجة إلى معدات تصوير متطورة لمراقبة تطور الأورام الداخلية 6,7. على النقيض من ذلك ، يتيح نموذج الزرد (Danio rerio) سعة أكبر ، ومدة أقصر ، ونفقات أقل ، وبسبب شفافيتها ، مراقبة بسيطة لتطور المرض 8,9.
الزرد هو نظام نموذجي متطور للفقاريات مع تطور خارج الرحم وخصوبة عالية ، حيث تنتج الإناث الفردية أكثر من 100 جنين10. علاوة على ذلك ، فإن أجنة الزرد شفافة ، مما يتيح تصورا سهلا للعمليات التنموية باستخدام التقنيات المتعلقة بالتألق مثل المراسلين. أخيرا ، فإن الحفاظ على العمليات التنموية الحرجة يجعلها نموذجا مثاليا للعديد من أنواع الدراسات ، بما في ذلك سلوك الخلايا الخبيثة المزروعة11,12. تطور أجنة الزرد من النوع البري الخلايا الصباغية ، مما يجعلها معتمة بصريا بحلول 2 أسابيع من العمر ، ولكن تم التغلب على ذلك من خلال توليد أجنة كاسبر (roya9; MitfaW2) ، والتي تظل شفافة طوال الحياة13. بسبب خصائصها البصرية ، فإن الزرد كاسبر هي المتلقين المثاليين للخلايا السرطانية المزروعة14،15،16. اكتسبت زراعة الخلايا السرطانية في الزرد أهمية في العقدين الماضيين17،18،19،20،21. أجنة الزرد لها مناعة فطرية. ومع ذلك ، فإنها تفتقر إلى المناعة التكيفية خلال مرحلة اليرقات ، مما يجعلها منقوصة المناعة وظيفيا ، مما يمكنها من العمل كمضيفين فعالين للطعوم الخارجية للورمالمزروع 22.
تم تطوير بروتوكولات لتطعيم الورم في أجنة الزرد وكذلك البالغين الذين أخذوا في الاعتبار عددا من المتغيرات المختلفة23،24،25،26،27. وقد استكشفت هذه العديد من مواقع ترسب الورم في الزرد ، بما في ذلك الحقن في صفار البيض ، والفضاء شبه vitelline ، والقلب وفي مراحل النمو المختلفة16،28. كما أن درجة الحرارة المحيطة للاستزراع المائي للطعوم الخارجية لأسماك الزرد مهمة أيضا حيث أن تربية أسماك الزرد تحدث عادة عند 28 درجة مئوية، بينما تنمو خلايا الثدييات عند 37 درجة مئوية. وبالتالي ، يجب استخدام درجة حرارة توفيقية تتحملها الأسماك ولكنها تدعم نمو الورم ، ويبدو أن 34 درجة مئوية تحقق كلا الهدفين29. يعد تحليل سلوك الأورام وتطورها بعد زراعة الأعضاء الخارجية مجالا رئيسيا آخر للتركيز ، وهذا ينطوي على استخدام مجموعة متنوعة من طرق التصوير بالإضافة إلى تحليل البقاء على قيد الحياة30. واحدة من المزايا الرئيسية لنموذج الزرد هو توافر أعداد كبيرة من الدراسة لتوفير قوة إحصائية هائلة للدراسات في الجسم الحي لسلوك الورم. ومع ذلك ، فقد حدت الأساليب السابقة بشدة من هذه الإمكانات بسبب متطلبات إجراءات التركيب المملة للحقن.
هنا ، نعالج هذا القيد من خلال تطوير طريقة بسيطة وسريعة يمكن من خلالها تحديد مرحلة الأجنة التي تتيح إنتاجية عالية ومراقبة جودة الحقن باستخدام خط الزرد كاسبر الشفاف. وهذا يستلزم حقن الطعوم الخارجية في كيس صفار أجنة الزرد كاسبر في 2 أيام بعد الإخصاب (dpf). نلاحظ بقاء الأجنة بعد زراعة الأعضاء كجزء من تحليل سلوك الورم. نعرض كذلك تقييم عبء المرض بعد زراعة الأعضاء عن طريق إجراء معلقات أحادية الخلية وتحليلها عن طريق قياس التدفق الخلوي (الشكل 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
برزت زراعة الأجانب لسمك الزرد كبديل سريع وقوي وفعال من حيث التكلفة لدراسات الفئران12. على الرغم من الإبلاغ عن عدة طرق لزراعة الزرد ، فقد أدى تكيفنا إلى تحسينات كبيرة. بالإضافة إلى توحيد المعلمات حول الإجراء ، تركز هذه التحسينات بشكل خاص على تسريع معدل إجراء حقن الورم ، وبالتال?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم دعم هذا العمل من خلال منح المعاهد الوطنية للصحة R37AI110985 و P30CA006927 ، وهو اعتماد من كومنولث بنسلفانيا ، وجمعية اللوكيميا والأورام اللمفاوية ، وصندوق الأسقف. تم دعم هذه الدراسة أيضا من قبل المرافق الأساسية في Fox Chase ، بما في ذلك زراعة الخلايا ، وقياس التدفق الخلوي ، ومنشأة المختبر. نشكر الدكتورة جينيفر رودس على صيانة مرفق الزرد والحقن المجهري في FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
