En enkel, hurtig og effektiv metode til tumorxenotransplantationsanalyse i gennemsigtige zebrafiskembryoner
Summary
Vi beskriver en protokol for xenotransplantation i æggeblommen på gennemsigtige zebrafiskembryoner, der optimeres ved en enkel, hurtig iscenesættelsesmetode. Analyser efter injektion omfatter overlevelse og vurdering af sygdomsbyrden af xenotransplanterede celler ved flowcytometri.
Abstract
In vivo-undersøgelser af tumoradfærd er en fast bestanddel af kræftforskning; Brugen af mus giver dog betydelige udfordringer i omkostninger og tid. Her præsenterer vi larvezebrafisk som en transplantationsmodel, der har adskillige fordele i forhold til murinmodeller, herunder nem håndtering, lave omkostninger og kort eksperimentel varighed. Desuden fjerner fraværet af et adaptivt immunsystem under larvestadier behovet for at generere og bruge immundefekte stammer. Mens der findes etablerede protokoller for xenotransplantation i zebrafiskembryoner, præsenterer vi her en forbedret metode, der involverer embryostadieinddeling for hurtigere overførsel, overlevelsesanalyse og brug af flowcytometri til at vurdere sygdomsbyrden. Embryoner er iscenesat for at lette hurtig celleinjektion i larvernes æggeblomme og cellemarkering for at overvåge konsistensen af den injicerede cellebolus. Efter injektion vurderes embryooverlevelsesanalysen op til 7 dage efter injektionen (dpi). Endelig vurderes sygdomsbyrden også ved at mærke overførte celler med et fluorescerende protein og analysere ved flowcytometri. Flowcytometri er muliggjort af en standardiseret metode til fremstilling af cellesuspensioner fra zebrafiskembryoner, som også kan bruges til at etablere den primære kultur af zebrafiskceller. Sammenfattende tillader den procedure, der er beskrevet her, en hurtigere vurdering af tumorcellers adfærd in vivo med et større antal dyr pr. undersøgelsesarm og på en mere omkostningseffektiv måde.
Introduction
Analyse af tumorers opførsel som reaktion på genetisk ændring eller lægemiddelbehandling in vivo er et væsentligt element i kræftforskning 1,2,3,4. Sådanne undersøgelser involverer oftest brugen af immunkompromitterede musemodeller (Mus musculus)5; Imidlertid er xenotransplantationsundersøgelser i mus begrænsede i mange henseender, herunder begrænset kapacitet, forlænget varighed, betydelige udgifter og kravet om sofistikeret billedbehandlingsudstyr til at overvåge progressionen af indre tumorer 6,7. I modsætning hertil muliggør zebrafiskmodellen (Danio rerio) større kapacitet, kortere varighed, lavere omkostninger og på grund af deres gennemsigtighed simpel overvågning af sygdomsprogression 8,9.
Zebrafisk er et veludviklet hvirveldyrmodelsystem med ex-utero udvikling og høj frugtbarhed, hvor individuelle hunner producerer mere end 100 embryoner10. Desuden er zebrafiskembryoner gennemsigtige, hvilket gør det nemt at visualisere udviklingsprocesser ved hjælp af fluorescensrelaterede teknikker såsom reportere. Endelig gør bevarelsen af kritiske udviklingsprocesser dem til en ideel model for mange typer undersøgelser, herunder adfærden af transplanterede ondartede celler11,12. Vildtype-zebrafiskembryoner udvikler melanocytter, som gør dem optisk uigennemsigtige ved 2 ugers alderen, men dette er blevet overvundet af genereringen af casper-embryoner (roya9; mitfaw2), som forbliver gennemsigtige gennem hele livet13. På grund af deres optiske egenskaber er casper zebrafisk ideelle modtagere af transplanterede tumorceller 14,15,16. Xenotransplantation af tumorceller til zebrafisk har fået betydning i de sidste 2 årtier 17,18,19,20,21. Zebrafiskembryoner har medfødt immunitet; de mangler dog adaptiv immunitet i deres larvefase, hvilket gør dem funktionelt immunkompromitterede, hvilket gør dem i stand til at tjene som effektive værter for transplanterede tumorxenotransplantater22.
Der er udviklet protokoller for tumortransplantation i zebrafiskembryoner såvel som voksne, der har overvejet en række forskellige variabler 23,24,25,26,27. Disse har udforsket adskillige steder med tumoraflejring hos zebrafisk, herunder injektioner i æggeblomme, peri-vitellin rum og hjerte og på forskellige udviklingsstadier16,28. Den omgivende temperatur i akvakultur for zebrafisk xenotransplantater er også vigtig, da zebrafiskopdræt typisk sker ved 28 °C, mens pattedyrceller vokser ved 37 °C. Derfor skal der anvendes en kompromistemperatur, der tolereres af fisken, men som understøtter tumorvækst, og 34 °C ser ud til at nå begge mål29. Analyse af tumorers adfærd og progression efter xenotransplantation er et andet stort fokusområde, og dette involverer brugen af en række billeddannelsesmodaliteter samt overlevelsesanalyse30. En af de største fordele ved zebrafiskmodellen er tilgængeligheden af et stort antal forsøgsdyr for at give enorm statistisk kraft til in vivo-undersøgelser af tumoradfærd; Tidligere tilgange har dog i høj grad begrænset dette potentiale på grund af kravet om kedelige monteringsprocedurer for injektioner.
Her adresserer vi denne begrænsning gennem udviklingen af en enkel, hurtig metode til at iscenesætte embryoner, der muliggør høj gennemstrømning og overvågning af injektionskvaliteten ved hjælp af den gennemsigtige casper zebrafiskeline. Dette indebærer injektion af xenotransplantater i blommesækken på casper-zebrafiskembryonerne 2 dage efter befrugtning (dpf). Vi observerer overlevelsen af embryoner efter xenotransplantation som en del af tumoradfærdsanalyse. Vi viser yderligere vurderingen af sygdomsbyrden efter xenotransplantation ved at lave enkeltcellesuspensioner og analysere ved flowcytometri (figur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Zebrafisk xenotransplantation er dukket op som et hurtigt, robust og omkostningseffektivt alternativ til museundersøgelser12. Selvom der er rapporteret om flere tilgange til zebrafiskxenotransplantation, har vores tilpasning resulteret i betydelige forbedringer. Ud over at standardisere parametre omkring proceduren fokuserer disse forbedringer specifikt på at fremskynde den hastighed, hvormed tumorinjektioner kan udføres, hvilket muliggør en stigning i antallet af dyr pr. undersøgelsesarm og …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NIH-bevillinger R37AI110985 og P30CA006927, en bevilling fra Commonwealth of Pennsylvania, Leukemia and Lymphoma Society og Bishop Fund. Denne undersøgelse blev også støttet af kernefaciliteterne på Fox Chase, herunder cellekultur, flowcytometri og forsøgsdyrsfacilitet. Vi takker Dr. Jennifer Rhodes for at vedligeholde zebrafisk- og mikroinjektionsanlægget på FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
