Een eenvoudige, snelle en effectieve methode voor tumor xenotransplantatie analyse in transparante zebravis embryo's
Summary
We beschrijven een protocol voor xenotransplantatie in de dooier van transparante zebravisembryo’s dat wordt geoptimaliseerd door een eenvoudige, snelle stadiëringsmethode. Analyses na injectie omvatten overleving en het beoordelen van de ziektelast van xenogetransplanteerde cellen door middel van flowcytometrie.
Abstract
In vivo studies naar tumorgedrag zijn een hoofdbestanddeel van kankeronderzoek; Het gebruik van muizen brengt echter aanzienlijke uitdagingen met zich mee op het gebied van kosten en tijd. Hier presenteren we larvale zebravissen als een transplantatiemodel dat tal van voordelen heeft ten opzichte van muizenmodellen, waaronder gebruiksgemak, lage kosten en korte experimentele duur. Bovendien maakt de afwezigheid van een adaptief immuunsysteem tijdens de larvale stadia de noodzaak overbodig om immunodeficiënte stammen te genereren en te gebruiken. Hoewel er gevestigde protocollen voor xenotransplantatie in zebravisembryo’s bestaan, presenteren we hier een verbeterde methode met embryostadiëring voor snellere overdracht, overlevingsanalyse en het gebruik van flowcytometrie om de ziektelast te beoordelen. Embryo’s worden in scène gezet om snelle celinjectie in de dooier van de larven te vergemakkelijken en celmarkering om de consistentie van de geïnjecteerde celbolus te controleren. Na injectie wordt de analyse van de embryooverleving tot 7 dagen na injectie (dpi) beoordeeld. Ten slotte wordt ook de ziektelast beoordeeld door overgedragen cellen te markeren met een fluorescerend eiwit en analyse door middel van flowcytometrie. Flowcytometrie wordt mogelijk gemaakt door een gestandaardiseerde methode voor het bereiden van celsuspensies uit zebravisembryo’s, die ook kan worden gebruikt bij het vaststellen van de primaire cultuur van zebraviscellen. Samenvattend maakt de hier beschreven procedure een snellere beoordeling van het gedrag van tumorcellen in vivo mogelijk met grotere aantallen dieren per onderzoeksarm en op een meer kosteneffectieve manier.
Introduction
Analyse van het gedrag van tumoren als reactie op genetische verandering of medicamenteuze behandeling in vivo is een essentieel onderdeel van kankeronderzoek 1,2,3,4. Dergelijke studies omvatten meestal het gebruik van immuungecompromitteerde muismodellen (Mus musculus)5; Xenotransplantatiestudies bij muizen zijn echter in veel opzichten beperkt, waaronder beperkte capaciteit, langere duur, aanzienlijke kosten en de vereiste van geavanceerde beeldvormingsapparatuur om de progressie van inwendige tumoren te volgen 6,7. Het zebravismodel (Danio rerio) daarentegen maakt een grotere capaciteit, een kortere duur, lagere kosten en, dankzij hun transparantie, eenvoudige monitoring van de ziekteprogressie mogelijk 8,9.
Zebravis is een goed ontwikkeld modelsysteem van gewervelde dieren met ex-utero ontwikkeling en hoge vruchtbaarheid, waarbij individuele vrouwtjes meer dan 100 embryo’s produceren10. Bovendien zijn zebravisembryo’s transparant, waardoor ontwikkelingsprocessen gemakkelijk kunnen worden gevisualiseerd met behulp van fluorescentiegerelateerde technieken zoals reporters. Ten slotte maakt het behoud van kritieke ontwikkelingsprocessen ze tot een ideaal model voor vele soorten studies, waaronder het gedrag van getransplanteerde kwaadaardige cellen11,12. Wildtype zebravisembryo’s ontwikkelen melanocyten, waardoor ze optisch ondoorzichtig zijn als ze 2 weken oud zijn, maar dit is overwonnen door de generatie van casper-embryo’s (roya9; MitfaW2), die gedurende het hele leven transparant blijven13. Vanwege hun optische eigenschappen zijn casper zebravissen ideale ontvangers van getransplanteerde tumorcellen 14,15,16. Xenotransplantatie van tumorcellen in zebravissen heeft in de afgelopen 2 decennia aan belang gewonnen 17,18,19,20,21. Zebravisembryo’s hebben een aangeboren immuniteit; Ze missen echter adaptieve immuniteit tijdens hun larvale stadium, waardoor ze functioneel immuungecompromitteerd zijn, waardoor ze kunnen dienen als effectieve gastheren voor getransplanteerde tumorxenotransplantaten22.
Er zijn protocollen ontwikkeld voor tumorimplantatie in zebravisembryo’s en volwassenen die rekening hebben gehouden met een aantal verschillende variabelen 23,24,25,26,27. Deze hebben talloze plaatsen van tumorafzetting in zebravissen onderzocht, waaronder injecties in dooier, peri-vitelline-ruimte en hart en in verschillende ontwikkelingsstadia16,28. De omgevingstemperatuur van de aquacultuur voor xenotransplantaten van zebravissen is ook belangrijk, aangezien de kweek van zebravissen doorgaans plaatsvindt bij 28 °C, terwijl zoogdiercellen groeien bij 37 °C. Daarom moet een compromistemperatuur worden gehanteerd die door de vissen wordt verdragen en toch de tumorgroei ondersteunt, en 34 °C lijkt beide doelen te bereiken29. Analyse van het gedrag en de progressie van tumoren na xenotransplantatie is een ander belangrijk aandachtsgebied, en dit omvat het gebruik van een verscheidenheid aan beeldvormingsmodaliteiten en overlevingsanalyse30. Een van de grote voordelen van het zebravismodel is de beschikbaarheid van grote aantallen studiedieren om een enorme statistische kracht te bieden aan in vivo studies van tumorgedrag; Eerdere benaderingen hebben dit potentieel echter ernstig beperkt vanwege de vereiste van vervelende montageprocedures voor injecties.
Hier pakken we deze beperking aan door de ontwikkeling van een eenvoudige, snelle methode om embryo’s in scène te zetten die een hoge doorvoer en monitoring van de injectiekwaliteit mogelijk maakt met behulp van de transparante casper zebravislijn. Dit houdt in dat xenotransplantaten 2 dagen na de bevruchting (dpf) in de dooierzak van de casper-zebravisembryo’s worden geïnjecteerd. We observeren de overleving van embryo’s na xenotransplantatie als onderdeel van de analyse van tumorgedrag. We tonen verder de beoordeling van de ziektelast na xenotransplantatie door het maken van eencellige suspensies en analyse door middel van flowcytometrie (Figuur 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
Xenotransplantatie van zebravissen is naar voren gekomen als een snel, robuust en kosteneffectief alternatief voor muizenstudies12. Hoewel er verschillende benaderingen van xenotransplantatie van zebravissen zijn gemeld, heeft onze aanpassing geleid tot aanzienlijke verbeteringen. Naast het standaardiseren van parameters rond de procedure, richten deze verbeteringen zich specifiek op het versnellen van de snelheid waarmee tumorinjecties kunnen worden uitgevoerd, waardoor een toename van het aantal…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door NIH-subsidies R37AI110985 en P30CA006927, een krediet van het Gemenebest van Pennsylvania, de Leukemia and Lymphoma Society en het Bishop Fund. Deze studie werd ook ondersteund door de kernfaciliteiten van Fox Chase, waaronder celcultuur, flowcytometrie en laboratoriumdierfaciliteit. We danken Dr. Jennifer Rhodes voor het onderhouden van de zebravis en micro-injectiefaciliteit bij FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
