Une méthode simple, rapide et efficace pour l’analyse de la xénotransplantation tumorale dans les embryons de poisson-zèbre transparent
Summary
Nous décrivons un protocole de xénotransplantation dans le jaune d’embryons de poisson-zèbre transparent qui est optimisé par une méthode de stadification simple et rapide. Les analyses post-injection comprennent la survie et l’évaluation de la charge de morbidité des cellules xénotransplantées par cytométrie en flux.
Abstract
Les études in vivo du comportement tumoral sont un élément essentiel de la recherche sur le cancer ; Cependant, l’utilisation de souris présente des défis importants en termes de coût et de temps. Ici, nous présentons les larves de poisson-zèbre comme un modèle de transplantation qui présente de nombreux avantages par rapport aux modèles murins, notamment la facilité de manipulation, le faible coût et la courte durée d’expérience. De plus, l’absence d’un système immunitaire adaptatif pendant les stades larvaires rend inutile la production et l’utilisation de souches immunodéficientes. Bien qu’il existe des protocoles établis pour la xénotransplantation chez les embryons de poisson-zèbre, nous présentons ici une méthode améliorée impliquant la stadification des embryons pour un transfert plus rapide, l’analyse de la survie et l’utilisation de la cytométrie en flux pour évaluer le fardeau de la maladie. Les embryons sont stagénés pour faciliter l’injection rapide de cellules dans le jaune des larves et le marquage cellulaire pour surveiller la consistance du bolus cellulaire injecté. Après l’injection, l’analyse de la survie embryonnaire est évaluée jusqu’à 7 jours après l’injection (dpi). Enfin, la charge de morbidité est également évaluée par le marquage des cellules transférées avec une protéine fluorescente et l’analyse par cytométrie en flux. La cytométrie en flux est rendue possible par une méthode standardisée de préparation de suspensions cellulaires à partir d’embryons de poisson-zèbre, qui pourrait également être utilisée pour établir la culture primaire de cellules de poisson-zèbre. En résumé, la procédure décrite ici permet une évaluation plus rapide du comportement des cellules tumorales in vivo avec un plus grand nombre d’animaux par bras d’étude et de manière plus rentable.
Introduction
L’analyse du comportement des tumeurs en réponse à une altération génétique ou à un traitement médicamenteux in vivo est un élément essentiel de la recherche sur le cancer 1,2,3,4. De telles études impliquent le plus souvent l’utilisation de modèles de souris immunodéprimées (Mus musculus)5 ; Cependant, les études de xénotransplantation chez la souris sont limitées à bien des égards, notamment en raison de leur capacité limitée, de leur durée prolongée, de leurs dépenses importantes et de la nécessité d’un équipement d’imagerie sophistiqué pour surveiller la progression des tumeurs internes 6,7. En revanche, le modèle du poisson-zèbre (Danio rerio) permet une plus grande capacité, une durée plus courte, des dépenses moindres et, en raison de sa transparence, un suivi simple de la progression de la maladie 8,9.
Le poisson-zèbre est un système modèle de vertébré bien développé avec un développement ex-utero et une fécondité élevée, avec des femelles individuelles produisant plus de 100 embryons10. De plus, les embryons de poisson-zèbre sont transparents, ce qui permet de visualiser facilement les processus de développement à l’aide de techniques liées à la fluorescence telles que les rapporteurs. Enfin, la conservation des processus de développement critiques en fait un modèle idéal pour de nombreux types d’études, y compris le comportement des cellules malignes transplantées11,12. Les embryons de poisson-zèbre de type sauvage développent des mélanocytes, ce qui les rend optiquement opaques à l’âge de 2 semaines, mais cela a été surmonté par la génération d’embryons de casper (roya9 ; mitfaw2), qui restent transparents tout au long de leur vie13. En raison de leurs propriétés optiques, les poissons-zèbres casper sont des receveurs idéaux de cellules tumorales transplantées 14,15,16. La xénotransplantation de cellules tumorales chez le poisson-zèbre a gagné en importance au cours des 2 dernières décennies 17,18,19,20,21. Les embryons de poisson-zèbre ont une immunité innée ; Cependant, ils n’ont pas d’immunité adaptative au cours de leur stade larvaire, ce qui les rend fonctionnellement immunodéprimés, ce qui leur permet de servir d’hôtes efficaces pour les xénogreffes tumorales transplantées22.
Des protocoles ont été développés pour la greffe tumorale chez les embryons de poisson-zèbre ainsi que chez les adultes qui ont pris en compte un certain nombre de variables différentes 23,24,25,26,27. Ceux-ci ont exploré de nombreux sites de dépôt tumoral chez le poisson zèbre, y compris des injections dans le vitellus, l’espace périvitellin et le cœur et à différents stades de développement16,28. La température ambiante de l’aquaculture pour les xénogreffes de poisson-zèbre est également importante, car l’élevage du poisson-zèbre se produit généralement à 28 °C, tandis que les cellules de mammifères se développent à 37 °C. Par conséquent, il faut utiliser une température de compromis qui soit tolérée par le poisson tout en favorisant la croissance tumorale, et 34 °C semble atteindre les deux objectifs29. L’analyse du comportement et de la progression des tumeurs après une xénotransplantation est un autre domaine d’intérêt majeur, et cela implique l’utilisation d’une variété de modalités d’imagerie ainsi que l’analyse de survie30. L’un des principaux avantages du modèle du poisson-zèbre est la disponibilité d’un grand nombre d’animaux à l’étude pour fournir une immense puissance statistique aux études in vivo du comportement tumoral ; Cependant, les approches précédentes ont considérablement limité ce potentiel en raison de l’exigence de procédures de montage fastidieuses pour les injections.
Ici, nous remédions à cette limitation en développant une méthode simple et rapide pour stadifier les embryons qui permet un débit élevé et un suivi de la qualité de l’injection à l’aide de la lignée transparente de poisson-zèbre casper . Cela implique l’injection de xénogreffes dans le sac vitellin des embryons de poisson-zèbre casper 2 jours après la fécondation (dpf). Nous observons la survie des embryons après une xénotransplantation dans le cadre de l’analyse du comportement tumoral. Nous montrons en outre l’évaluation de la charge de morbidité après une xénotransplantation en faisant des suspensions de cellules uniques et en analysant par cytométrie en flux (Figure 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
La xénotransplantation de poisson-zèbre est apparue comme une alternative rapide, robuste et rentable aux études sur les souris12. Bien que plusieurs approches de xénotransplantation de poisson-zèbre aient été rapportées, notre adaptation a entraîné des améliorations significatives. En plus de normaliser les paramètres autour de la procédure, ces améliorations se concentrent spécifiquement sur l’accélération de la vitesse à laquelle les injections tumorales peuvent être effect…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par des subventions des NIH R37AI110985 et P30CA006927, une affectation du Commonwealth de Pennsylvanie, de la Leukemia and Lymphoma Society et du Bishop Fund. Cette étude a également été soutenue par les installations centrales de Fox Chase, y compris la culture cellulaire, la cytométrie en flux et l’installation d’animaux de laboratoire. Nous remercions la Dre Jennifer Rhodes d’avoir maintenu l’installation de poisson-zèbre et de micro-injection au FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
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