שיטה פשוטה, מהירה ויעילה לניתוח השתלת גידול בעוברים שקופים של דגי זברה
Summary
אנו מתארים פרוטוקול להשתלת קסנו בחלמון של עוברי דגי זברה שקופים המותאם בשיטת היערכות פשוטה ומהירה. ניתוחים לאחר הזרקה כוללים הישרדות והערכת נטל המחלה של תאים מושתלים על ידי ציטומטריית זרימה.
Abstract
מחקרי In vivo של התנהגות גידולים הם מצרך עיקרי בחקר הסרטן; עם זאת, השימוש בעכברים מציב אתגרים משמעותיים בעלות ובזמן. כאן, אנו מציגים את דגי הזברה הזחלים כמודל השתלה שיש לו יתרונות רבים על פני מודלים מורינים, כולל קלות טיפול, הוצאות נמוכות ומשך ניסוי קצר. יתר על כן, היעדר מערכת חיסון נרכשת בשלבי הזחל מייתר את הצורך לייצר זנים מדוכאי חיסון ולהשתמש בהם. בעוד פרוטוקולים מבוססים להשתלת קסנו בעוברים של דגי זברה קיימים, אנו מציגים כאן שיטה משופרת הכוללת היערכות עוברים להעברה מהירה יותר, ניתוח הישרדות ושימוש בציטומטריית זרימה להערכת נטל המחלה. עוברים מבוימים כדי להקל על הזרקת תאים מהירה לחלמון הזחלים וסימון תאים כדי לפקח על עקביות בולוס התא המוזרק. לאחר ההזרקה, ניתוח הישרדות העובר מוערך עד 7 ימים לאחר ההזרקה (dpi). לבסוף, נטל המחלה מוערך גם על ידי סימון תאים מועברים עם חלבון פלואורסצנטי וניתוח על ידי ציטומטריית זרימה. ציטומטריית זרימה מתאפשרת על ידי שיטה סטנדרטית להכנת תרחיפים של תאים מעוברי דגי זברה, אשר יכולה לשמש גם בביסוס התרבית הראשונית של תאי דגי זברה. לסיכום, ההליך המתואר כאן מאפשר הערכה מהירה יותר של התנהגות תאי הגידול in vivo עם מספר גדול יותר של בעלי חיים לכל זרוע מחקר ובאופן חסכוני יותר.
Introduction
ניתוח התנהגות גידולים בתגובה לשינוי גנטי או טיפול תרופתי in vivo הוא מרכיב חיוני בחקר הסרטן 1,2,3,4. מחקרים כאלה כוללים לרוב שימוש במודלים של עכבר מדוכא חיסון (Mus musculus)5; עם זאת, מחקרי השתלת קסנו בעכברים מוגבלים במובנים רבים, כולל קיבולת מוגבלת, משך זמן ממושך, הוצאות משמעותיות והדרישה לציוד הדמיה מתוחכם למעקב אחר התקדמות גידולים פנימיים 6,7. לעומת זאת, מודל דגי הזברה (Danio rerio) מאפשר קיבולת גדולה יותר, משך זמן קצר יותר, הוצאות נמוכות יותר, ובשל שקיפותם, ניטור פשוט של התקדמות המחלה 8,9.
דגי זברה היא מערכת מודל מפותחת של בעלי חוליות עם התפתחות רחם לשעבר ופריון גבוה, כאשר נקבות בודדות מייצרות יותר מ-100 עוברים10. יתר על כן, עוברים של דגי זברה הם שקופים, ומאפשרים הדמיה קלה של תהליכים התפתחותיים באמצעות טכניקות הקשורות לפלואורסצנטיות כגון כתבים. לבסוף, שימור תהליכים התפתחותיים קריטיים הופך אותם למודל אידיאלי עבור סוגים רבים של מחקרים, כולל ההתנהגות של תאים ממאירים מושתלים11,12. עוברי דגי זברה מסוג בר מפתחים מלנוציטים, מה שהופך אותם אטומים אופטית עד גיל שבועיים, אך זה כבר התגבר על ידי הדור של עוברי קספר (RoyA9; MitfaW2), שנשארים שקופים לאורך כל החיים13. בגלל התכונות האופטיות שלהם, דגי זברה קספר הם מושתלים אידיאליים של תאי גידול מושתלים 14,15,16. השתלת קסנו של תאי גידול בדגי זברה צברה חשיבות בשני העשורים האחרונים 17,18,19,20,21. לעוברים של דגי זברה יש חסינות מולדת; עם זאת, הם חסרים חסינות נרכשת בשלב הזחל שלהם, מה שהופך אותם מדוכאי חיסון תפקודיים, מה שמאפשר להם לשמש כמארחים יעילים עבור xenografts גידול מושתל22.
פותחו פרוטוקולים לקליטת גידולים בעוברים של דגי זברה וכן במבוגרים שלקחו בחשבון מספר משתנים שונים 23,24,25,26,27. אלה חקרו אתרים רבים של שקיעת גידולים בדגי זברה, כולל זריקות בחלמון, בחלל פרי-ויטלין ובלב ובשלבי התפתחות שונים16,28. טמפרטורת הסביבה של חקלאות ימית עבור xenografts דגי זברה חשוב גם כמו גידול דגי זברה מתרחשת בדרך כלל ב 28 °C (75 °F), בעוד תאים יונקים לגדול ב 37 °C (77 °F). כתוצאה מכך, יש להשתמש בטמפרטורת פשרה שנסבלת על ידי הדג אך תומכת בצמיחת הגידול, ונראה כי 34 מעלות צלזיוס משיגות את שתי המטרות29. ניתוח ההתנהגות וההתקדמות של גידולים לאחר השתלת קסנו הוא תחום מרכזי נוסף של התמקדות, וזה כרוך בשימוש במגוון שיטות הדמיה, כמו גם ניתוח הישרדות30. אחד היתרונות העיקריים של מודל דגי הזברה הוא זמינותם של מספר רב של חיות מחקר כדי לספק כוח סטטיסטי עצום למחקרי in vivo של התנהגות גידולים; עם זאת, גישות קודמות הגבילו מאוד את הפוטנציאל הזה בגלל הדרישה של הליכי הרכבה מייגעים לזריקות.
כאן, אנו מתמודדים עם מגבלה זו באמצעות פיתוח שיטה פשוטה ומהירה לשלב עוברים המאפשרת תפוקה גבוהה וניטור של איכות ההזרקה באמצעות קו דגי הזברה השקופים של קספר . זה כרוך בהזרקה של xenografts לתוך שק החלמון של עוברי דג זברה קספר ב 2 ימים לאחר ההפריה (dpf). אנו צופים בהישרדות העוברים לאחר השתלת קסנו כחלק מניתוח התנהגות הגידול. אנו גם מראים את הערכת נטל המחלה לאחר השתלת קסנו על-ידי ביצוע תרחיפים של תאים בודדים וניתוח על-ידי ציטומטריית זרימה (איור 1).
Protocol
Representative Results
Discussion
השתלת שדגי זברה התגלתה כחלופה מהירה, חזקה וחסכונית למחקרי עכברים12. למרות שדווחו מספר גישות להשתלת קסנו של דגי זברה, ההסתגלות שלנו הביאה לשיפור משמעותי. בנוסף לסטנדרטיזציה של הפרמטרים סביב ההליך, שיפורים אלה מתמקדים באופן ספציפי בהאצת הקצב שבו ניתן לבצע זריקות גידול, ובכך מאפ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי מענקי NIH R37AI110985 ו-P30CA006927, הקצאה מחבר העמים של פנסילבניה, האגודה ללוקמיה ולימפומה וקרן בישופ. מחקר זה נתמך גם על ידי מתקני הליבה של פוקס צ’ייס, כולל Cell Culture, Flow Cytometry ומתקן חיות מעבדה. אנו מודים לד”ר ג’ניפר רודס על תחזוקת דגי הזברה ומתקן המיקרו-הזרקה ב-FCCC.
Materials
| 1-phenyl 2-thiourea (PTU) | Sigma | P7629 | |
| 70 micron cell strainer | Corning | CLS431751-50EA | |
| 90 mm Petri dish | Thermo Fisher Scientific | S43565 | |
| Agarose | Apex bioresearch | 20-102GP | |
| APC APC anti-mouse CD45.2 Antibody | Biolegend | 109814 | |
| BD FACSymphony A5 Cell Analyzer | BD Biosciences | BD FACSymphony A5 | |
| calibration capillaries | Sigma | P1424-1PAK | |
| Cell tracker CM-dil dye | Invitrogen | C7001 | |
| Collageanse IV | Gibco | 17104019 | |
| Dumont forceps number 55 | Fine science tools | 11255-20 | |
| FBS | Corning | 35-015-CV | |
| Fluorescence microscope | Nikon | model SMZ1500 | |
| Glass capillaries (Borosilicate) | World precision instruments | 1B100-4 | |
| HBSS | Corning | 21-023-CV | |
| Helix NP Blue | Biolegend | 425305 | |
| Instant Ocean Sea Salt | Instant ocean | SS15-10 | |
| Light microscope | Nikon | model SMZ1000 | |
| Methylene blue | Sigma | M9140-100G | |
| Microloader (long tips for laoding cells) | eppendorf | 930001007 | |
| P1000 micropipette puller | Sutter instruments | model P-97 | |
| PM 1000 cell microinjector | MicroData Instruments, Inc. (MDI) | PM1000 | |
| Tricaine methanesulphate (Ethyl 3- aminobenzoate methanesulphate) | Sigma | E10521-10G | |
| Trypsin-EDTA (0.5%), no phenol red | Gibco | 15400054 | |
| Zebrafish adult irradiated diet (dry feed) | Zeigler | 388763 |
References
- Sharma, G., Goyal, Y., Bhatia, S. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. Preclinical Animal Models of Cancer: Applications and Limitations. , (2022).
- Singhal, S. S., et al. Recent advancement in breast cancer research: Insights from model organisms-Mouse models to zebrafish. Cancers. 15 (11), 2961 (2023).
- Liu, Y., et al. Patient-derived xenograft models in cancer therapy: technologies and applications. Signal Transduction and Targeted Therapy. 8 (1), 160 (2023).
- Fuochi, S., Galligioni, V. Disease Animal Models for Cancer Research. Cancer Cell Culture: Methods and Protocols. , (2023).
- Shaw, T. J., Senterman, M. K., Dawson, K., Crane, C. A., Vanderhyden, B. C. Characterization of intraperitoneal, orthotopic, and metastatic xenograft models of human ovarian cancer. Mol Ther. 10 (6), 1032-1042 (2004).
- Deroose, C. M., et al. Multimodality imaging of tumor xenografts and metastases in mice with combined small-animal PET, small-animal CT, and bioluminescence imaging. J Nucl Med. 48 (2), 295-303 (2007).
- Zeng, M., et al. Generation, evolution, interfering factors, applications, and challenges of patient-derived xenograft models in immunodeficient mice. Cancer Cell Int. 23 (1), 120 (2023).
- Adhish, M., Manjubala, I. Effectiveness of zebrafish models in understanding human diseases-A review of models. Heliyon. 9 (3), e14557 (2023).
- MacRae, C. A., Peterson, R. T. Zebrafish as a mainstream model for in vivo systems pharmacology and toxicology. Ann Rev Pharmacol Toxicol. 63, 43-64 (2023).
- Choe, S. -. K., Kim, C. -. H. Zebrafish: A powerful model for genetics and genomics. Int J Mol Sci. 24 (9), 8169 (2023).
- White, R., Rose, K., Zon, L. Zebrafish cancer: the state of the art and the path forward. Nat Rev Cancer. 13 (9), 624-636 (2013).
- Al-Hamaly, M. A., Turner, L. T., Rivera-Martinez, A., Rodriguez, A., Blackburn, J. S. Zebrafish cancer avatars: A translational platform for analyzing tumor heterogeneity and predicting patient outcomes. Int J Mol Sci. 24 (3), 2288 (2023).
- White, R. M., et al. Transparent adult zebrafish as a tool for in vivo transplantation analysis. Cell Stem Cell. 2 (2), 183-189 (2008).
- Hill, D., Chen, L., Snaar-Jagalska, E., Chaudhry, B. Embryonic zebrafish xenograft assay of human cancer metastasis. F1000Res. 7, 1682 (2018).
- Corkery, D. P., Dellaire, G., Berman, J. N. Leukaemia xenotransplantation in zebrafish–chemotherapy response assay in vivo. Br J Haematol. 153 (6), 786-789 (2011).
- Lin, J., et al. A clinically relevant in vivo zebrafish model of human multiple myeloma to study preclinical therapeutic efficacy. Blood. 128 (2), 249-252 (2016).
- Grissenberger, S., et al. High-content drug screening in zebrafish xenografts reveals high efficacy of dual MCL-1/BCL-XL inhibition against Ewing sarcoma. Cancer Lett. 554, 216028 (2023).
- Baxi, D. Zebrafish: A Versatile Animal Model to Study Tumorigenesis Process and Effective Preclinical Drug Screening for Human Cancer Research. Handbook of Animal Models and its Uses in Cancer Research. , (2022).
- Li, X., Li, M. The application of zebrafish patient-derived xenograft tumor models in the development of antitumor agents. Med Res Rev. 43 (1), 212-236 (2023).
- Yin, J., et al. Zebrafish patient-derived xenograft model as a preclinical platform for uveal melanoma drug discovery. Pharmaceuticals. 16 (4), 598 (2023).
- Nakayama, J., Makinoshima, H., Gong, Z. In vivo drug screening to identify anti-metastatic drugs in Twist1a-ER(T2) transgenic zebrafish. Bio Protoc. 13 (10), e4673-e4673 (2023).
- Lam, S., Chua, H., Gong, Z., Lam, T., Sin, Y. Development and maturation of the immune system in zebrafish, Danio rerio: a gene expression profiling, in situ hybridization and immunological study. Dev Comp Immunol. 28 (1), 9-28 (2004).
- Nicoli, S., Presta, M. The zebrafish/tumor xenograft angiogenesis assay. Nat Protoc. 2 (11), 2918-2923 (2007).
- Casey, M. J., et al. Transplantation of zebrafish pediatric brain tumors into immune-competent hosts for long-term study of tumor cell behavior and drug response. J Vis Exp. (123), e55712 (2017).
- Soh, G. H., Kögler, A. C., Müller, P. A simple and effective transplantation device for zebrafish embryos. J Vis Exp. (174), e62767 (2021).
- Martinez-Lopez, M., Póvoa, V., Fior, R. Generation of zebrafish larval xenografts and tumor behavior analysis. J Vis Exp. (172), e62373 (2021).
- Ren, J., Liu, S., Cui, C., Ten Dijke, P. Invasive behavior of human breast cancer cells in embryonic zebrafish. J Vis Exp. (122), e55459 (2017).
- Zhao, C., et al. A novel xenograft model in zebrafish for high-resolution investigating dynamics of neovascularization in tumors. PloS One. 6 (7), e21768 (2011).
- Cabezas-Sáinz, P., Pensado-López, A., Sáinz Jr, B., Sánchez, L. Modeling cancer using zebrafish xenografts: drawbacks for mimicking the human microenvironment. Cells. 9 (9), 1978 (2020).
- Haraoka, Y., Akieda, Y., Ishitani, T. Live-imaging analyses using small fish models reveal new mechanisms that regulate primary tumorigenesis. Yakugaku Zasshi. 139 (5), 733-741 (2019).
- Westerfield, M. . The Zebrafish Book. A Guide for the Laboratory Use of Zebrafish (Danio rerio). , (2000).
- Rao, S., et al. Inactivation of ribosomal protein L22 promotes transformation by induction of the stemness factor, Lin28B. Blood. 120 (18), 3764-3773 (2012).
- Goel, M. K., Khanna, P., Kishore, J. Understanding survival analysis: Kaplan-Meier estimate. Int J Ayurveda Res. 1 (4), 274-278 (2010).
- Usai, A., Di Franco, G., Gabellini, C., Morelli, L., Raffa, V. Establishment of zebrafish patient-derived xenografts from pancreatic cancer for chemosensitivity testing. J Vis Exp. (195), e63744 (2023).
- Murali Shankar, N., et al. Preclinical assessment of CAR-NK cell-mediated killing efficacy and pharmacokinetics in a rapid zebrafish xenograft model of metastatic breast cancer. Front Immunol. 14, 1254821 (2023).
- Takahi, M., et al. Xenograft of human pluripotent stem cell-derived cardiac lineage cells on zebrafish embryo heart. Biochem Biophys Res Commun. 674, 190-198 (2023).
- Rudner, L. A., et al. Shared acquired genomic changes in zebrafish and human T-ALL. Oncogene. 30 (41), 4289-4296 (2011).
- Regan, J. L., et al. RNA sequencing of long-term label-retaining colon cancer stem cells identifies novel regulators of quiescence. iScience. 24 (6), 102618 (2021).
